专利名称：解磷菌株pan 4及其在核桃促生中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，尤其涉及的是Pseudomonas vancouverensis Mohn et al解磷菌株PAN 4及其在核桃促生中的应用。
背景技术：
磷是植物生长发育所必需的营养元素，缺磷可导致农作物产量明显降低。土壤全磷含量虽然较高，但多以难溶态存在于土壤中，难以被植物吸收利用。生产上通过施用磷肥来解决土壤缺磷问题，不仅会耗竭有限的磷矿资源，还可能造成环境污染，破坏生态平衡。解磷细菌(phosphate solubilizing bacteria)是一类能够将土壤中植物难以吸收的磷转化为可利用状态磷的有益微生物，它通过活化土壤磷元素或影响植物根系分泌物的种类和数量，增加植物根系对周围K、Ca > Mg, Fe、Zn等营养元素的吸收，从而促进植物的生 长发育。目前，在解磷微生物的研究中多以禾本科作物为接种对象，且对解磷微生物促生效应的研究仅集中在对植株株高和生物量的影响。前人的研究结果表明接种解磷菌剂对水稻、玉米、燕麦、绿豆、甘蔗等作物均具有明显的促生效应。而以木本植物作为接种对象研究解磷菌剂的促生效应，国内外报道甚少。核桃广泛分布于世界各地，是我国重要的经济林木之一，因对水土保持的作用和其果实的营养保健功能，越来越受到重视。但是核桃植株生长对磷元素的需求量较大，磷是制约其生长的重要因子，目前未见Pseudomonas vancouverensis Mohn et al作为解憐菌剂在核桃上应用的报道。
发明内容
本发明的解磷菌株PAN 4菌株于2008年6月5采用稀释平板法分离于四川南充核桃根际，经鉴定为Pseudomonas vancouverensis Mohn et a。已经于2012年9月11日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏编号为CGMCC NO. 6546 ;分类命名为Pseudomonas vancouverensis。本发明涉及的Pseudomonasvancouverensis Mohn et al PAN 4新菌株，不仅解磷能力强，且高效促生核桃，改善根际微生物环境，促进植物生长，提高核桃苗光合生理特性和核桃苗磷素营养，具有促生优化根系微生态环境双重功能。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施例I Pseudomonas vancouverensis Mohn et al PAN 4 (CGMCC NO. 6546)液体制剂的发酵①一级斜面种子常规方法制作牛肉膏蛋白胨(蛋白胨10 g，牛肉膏3 g, NaCl 5g，琼脂15 g，蒸馏水1000 mL, pH 7. O)斜面培养基，接种PAN4后在26_28°C下培养24小时制成一级种子。②二级液体种子解磷细菌培养基[葡萄糖10 g，(NH4)2SO4 O. 5 g，NaCl O. 3 g，KCl O. 3 g, FeSO4 · 7H20 0. 03 g, MnSO4 · H 20 0. 03 g, MgSO4 · 7H20 0. 3 g, KH2PO4 2. 0 g,蒸馏水1000 mL])经高压灭菌后，按75mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种PAN4斜面种子，每瓶接种I支斜面种子，温度26-28°C，初始pH值7. 5，120r/min振荡培养36h，制成PAN4液体种子。③液体发酵葡萄糖20 g/L, (NH4Cl)L O g/L，初始pH值为7. 5，装液量为75 mL，经高压灭菌后，按75mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装瓶，在无菌状态接种PAN4液体种子，接种量4%，温度26-28°C，120r/min振荡培养72h，制成PAN4液体制剂。比浊法测定菌体量(0D600值I. 100)，并同时接种I mL菌液于PKV液体培养基(葡萄糖10 g, (NH4)2SO4O. 5 g, NaCl O. 3 g, KCl O. 3 g, FeSO4 · 7H20 O. 03 g, MnSO4 · 4H20 O. 03 g, MgSO4 · 7H200.3 g, Ca3(PO4)2 10 g，蒸馏水1000 mlL,pH 7· 0 7· 5)，钥锑抗比色法测定其解磷能力达200mg/L 以上。·
(2)制剂保存瓶装制剂常温保存半年(1%甘油)或低温(4度)I年半不影响促生效果。(3)田间施用核桃按100-200倍(体积比)稀释度沿根系幅面灌根，每株200毫升，春、夏各一次，连续三年，可促进核桃生长(株高、生物量)、提高核桃苗光合生理特性和核桃苗磷素营养；改善核桃根际微生物环境。实施例2试验于2009年3月起在四川农业大学林木种质圃进行，核桃苗生长期间进行常规管理，并定期轮换花盆的位置。试验土壤采自四川省雅安市大兴镇林木育种基地，采样深度为O 20 cm,砂壤土。土壤理化性质经测定为土壤pH 7. I,有机质含量10.43 g/kg,全氮含量0.80 g/kg,全磷含量0.34 g/kg,有效磷含量4.50 mg/kg。样土风干后过I mm筛，并与过I mm筛的河沙以3:1 (V: V)混合后用于盆栽试验。待核桃苗移栽成活后，分不同浓度在核桃根际周围用无菌注射器注射上述实施例I中的液体菌剂50 mL，重复6次，以每盆注射灭菌后的培养基(不含菌)50 mL对照。进行以下测定①核桃植株根际土壤微生物区系及生长的测定2009年10月中旬苗木停止生长后对根际土壤细菌、真菌、放线菌数量进行测定。测定方法为稀释平板法，细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基；放线菌采用改良高氏一号合成培养基，临用时在已融化的培养基中每300 mL培养基加3%重铬酸钾I mL ;真菌采用马丁氏孟加拉红培养基，临用时每100 mL培养基加1%链霉素液O. 3 mL,结果以每克干土所含数量表示。每处理重复5次。2009年10月中旬苗木停止生长后，分别测定其植株高度，并且每个处理选取5株生长一致的正常植株，将其根、茎、叶分别在105 °C下杀青30 min, 75 °C下烘干至恒重后称重，计算每株总生物量。结果见表I :表I解磷菌剂对核桃苗生长和根际微生物的影响
权利要求
1.解磷菌株PAN4菌株，保藏编号为CGMCC NO. 6546 ;分类命名为Pseudomonasvancouverensis。
2.根据权利要求I所述的解磷菌株PAN4菌株在核桃促生中的应用，按100-200倍稀释度沿根系幅面灌根，每株200毫升，春、夏各一次，连续三年，可促进核桃生长、提高核桃苗光合生理特性和核桃苗磷素营养；改善核桃根际微生物环境。
全文摘要
本发明公开了本发明的解磷菌株PAN 4已经于2012年9月11日保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.6546；分类命名为 Pseudomonas vancouverensis。本发明涉及的Pseudomonas vancouverensis Mohn et al PAN 4新菌株，不仅解磷能力强，且高效促生核桃，改善根际微生物环境，促进植物生长，提高核桃苗光合生理特性和核桃苗磷素营养，具有促生优化根系微生态环境双重功能。
文档编号A01G7/06GK102911895SQ20121036589
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者朱天辉, 李姝江, 余旋, 张丽娜, 谯天敏, 朴春根, 崔晓亮 申请人:四川农业大学