专利名称：一种用于提高荷斯坦公牛x精子冻后品质的冷冻稀释液配方的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种奶牛人工授精的改良技术，尤其涉及一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻精液稀释液配方。
背景技术：
家畜精液的冷冻成功为人工授精技术的发展产生了极其深远的影响，首先为扩大优秀种公畜的利用率和延长利用时间奠定了基础，其次为人工授精和低温生物学的发展提供了广阔的空间。由于冷冻精液在运输上比较方便，不论从时间还是从空间上，都使种公畜的配种效能得到充分发挥，加速了家畜品种改良的步伐。但是，不同性别的动物可以满足人们不同方面的需要，所以人们为了自身需要会通过各种办法去干预动物的正常生殖过程，使成年雌性动物生产出人们期望的性别后代，因而动物的性别差异直接影响其市场价值。·因此，性别控制技术在畜牧业生产中意义重大。在奶牛的生产中，目前已经实现X精子和Y精子的分离，通过人工授精成功的实现了对荷斯坦牛的性别控制。但现今荷斯坦牛性控冷冻精液解冻后的活力及受精率与鲜精相比还有很大差异，研究开发更有效的牛性控精液冷冻保护剂，提高性控精子冻后活力等具有重要的意义。在性控精液的x、Y精子分离过程中，获得经检测合格后的鲜精要经过染色、分离、平衡、离心、XY精子分离，稀释、分装、冷冻等一系列过程，这些程序会对精子造成一定的损伤，造成精子死亡及活力降低，严重影响精液品质，最终影响受精率，其中冷冻精液的稀释液配方是非常重要的影响因素。因此，根据目前的趋势，利用实验室条件对奶牛的性控精液稀释液配方进行深入研究，开发出新的精液稀释液，这样既可以提高荷斯坦牛X精子冻融后的存活率及受精率，又加快了我国奶牛的改良力度，为迅速提高奶牛的改良和产奶量，增加奶牛业的经济效益，拉动地方和区域经济发展具有积极的作用。以下是申请人检索的相关参考文献lMustafa S, Eserlf D. The effect of ascorbic acid on thefreezabiIity of ram semen diluted with extenders containing differentproportions of glycerolJ· Turkish Jourmal of Verterinary & animalScience, 2004，28(5) :893_910。2SinghB，Chand D. Siquality of deep frozen murrah buffalobull (Bubalus bubali s)semenJ· Journal of Pairying Food & HomeSciences, 1997，14(4) : 253-259。3Dawson，E.B.，Harris，W. A. , Teterj M. C. , Powel 1，L. C.，1992. Effectof ascorbic acid supplementation on the sperm quality of smokers. Fertil.Steril. 58，1034 - 1039。4Partida SLG, Setchell BP, Maxwell W M. Epididymal compounds and antioxidants in diluents for the frozen storage of ram spermatozoaJ·ReprodFertil Dev，1997，9(7):689_696。5FooteR H，Brockett C C，Kaproth M T. Motility and fertility of bullsperm in whole milk extender containing antioxidantsJ· Anim Reprod Sci，2002，71(1-2):13-23。6JonesR， Mann T.Damage to ram spermatozoa by peroxidantion ofendogenous phospholipids [J] . J Reprod Fertil，1997，50 (2):261-26。[7]Mustafa S,Esref D.The effect of ascorbic acid on the freezability ofram semen diluted with extenders containing different proportions of glycerolJ·Turkish Journal of Veterinary & Animal Science，2004，28 (5):893-910。8Aitken R J，Clarkson J S. Cellular basis of defective sperm functionand its association with the genesis of reactive oxygen species by humanspermatozoa [J] . J Reprod Fertil，1998，81:459-469.9Martia，L Mara b，J. I. Marti c，T. Seasonal variations in antioxidantenzyme activity in ram seminal plasma EJ· Theriogenology 67(2007) 1446 - 1454。[ IOjMedearos CMOj Forell Fj Oliveira ATD，et al. Current status of spermcrypereseration:Why isn’ t it better [ J].Theriogenologyj 2002, 57 :327 344。llUkeda H，Maeda S，Ishii T，Sawamura M. Spectrophotometric assay forsuperoxide dismutase basedon tetrazolium salt 3’_{1_(Phenylamino)-carbonyl-34-tetrazolium}-bis(4-methoxy-6-nitro)benzenesulphonic acid hydrate reductionby xanthinexanthine oxidase. Anal Biochem 1997 ；251 :206_209o12]TaleviR， Pelosi S，Sansone G，et al. Effects of different pre-freezingrates on buffalo sperm Motility and ultrastructure preservation [J]·Buffalo. 1999 (43) :537_539。13
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发明内容
针对X精子在冷冻过程中由于其处理方式与普通精液冷冻前处理方式相比，程序繁琐复杂，处理时间相对较长，处理过程中精子死亡率较高，导致精子活力低，配种后妊娠率低的缺陷，本发明的目的在于，提供一种用于提高荷斯坦牛X精子冷冻精液冻融后品质及受精率的新型精液稀释液配方。该稀释液可以明显提高分离以后的X精子冻后活率和顶体完整率及其他相关指标，从而提闻X精子冻融后的品质及受:精率。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液配方，其特征在于，制得的该冷冻稀释液每100毫升中含有以下物质柠檬酸钠0. 9 I. 2克，蔗糖3 6克，低密度脂蛋白16_18毫克，甘油4 7晕升，维生素E 500晕克 700晕克，维生素B12 100晕克 200晕克，壮观霉素0. 35晕克，庆大霉素-J 8万单位(IU)，蒸馏水补足100毫升。本发明一个优选的配方，100毫升冷冻稀释液中各物质含量为柠檬酸钠I. 073毫克，蔗糖4. 3毫克，低密度脂蛋白16毫克，甘油6毫升，维生素E600毫克，维生素B12150毫克，壮观霉素0. 35毫克，庆大霉素8万单位(IU)。上述用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液的配制方法，其特征在于，按下列步骤进行I)准确称取配方量的柠檬酸钠、蔗糖、低密度脂蛋白、维生素E、维生素B12和甘油，加蒸馏水至100毫升，在磁力搅拌器上搅动60分钟充分搅拌均匀，然后放入4°C冰箱过夜；2)精液稀释前加入壮观霉素和庆大霉素并搅拌10分钟，用酸或碱调整稀释液的酸碱度，用PH计测定稀释液的pH在6. 5 7. 5之间，然后用O. 22微米滤器对稀释液进行虑菌处理，虑菌处理后放入37. 5°C水浴锅中备用。
本发明首次把维生素E，维生素B12，加入到了冷冻稀释液中，并对冷冻稀释液的配制方法做了修正，实验数据表明，本发明的于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，提闻了 X精子冻融后的活力和精子顶体完整率，提闻了精子冻后品质。
具体实施例方式按照本发明的技术方案，本实施例给出一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，制得的该冷冻稀释液每100毫升中含有以下物质柠檬酸钠0. 9 I. 2克，蔗糖3 6克，低密度脂蛋白16_18毫克，甘油4 7晕升，维生素E 500晕克 700晕克，维生素B12 100晕克 200晕克，壮观霉素0. 35晕克，庆大霉素-J 8万单位(IU)，蒸馏水补足100毫升。其配制方法是I、称取原料柠檬酸钠，蔗糖，低密度脂蛋白，甘油，维生素E，维生素B12，蒸馏水。2、将以上的柠檬酸钠，蔗糖，低密度脂蛋白，维生素E，维生素B12,甘油，用蒸馏水配置成基础液，用磁力搅拌器搅拌60分钟，4°C冰箱内过夜备用。3、在精液稀释前加入庆大霉素，壮观霉素，然后在磁力搅拌器搅拌10分钟。4、用酸或碱调整稀释液pH值为6. 5 7. 5，然后用O. 22微米过滤器虑菌，虑菌后放入37. 5 °C水浴锅中备用。使用时，把经过预处理并由流式细胞仪分离后的X Y精子存放在装有已制备好的冷冻稀释液中，平衡五分钟后检查精子活力，活力正常的按照普通精液制作方法开始制作冷冻精液。并做好相关记录。本试验中，测定上述冷冻稀释液与传统配方的性控精液解冻后在A级精子百分率、B级精子百分率、顶体完整率、平均路径速度、平均移动角度、曲线运动速度、直线性、摆动性测摆幅度，直线运动速度进行比较。A级精子百分率、B级精子百分率、顶体完整率、平均路径速度、平均移动角度、曲线运动速度、直线性、摆动性测摆幅度，直线运动速度采用精子自动分析仪进行自动分析。顶体完整率及检测方法如下(I)精液解冻后立即在35°C 37°C的温度下进行活率检查。评定时，用玻璃棒蘸取I滴精液，滴于载玻片上，加上盖玻片，使盖玻片和载玻片之间充满精液，然后置于400倍 600倍显微镜下观察。在显微镜视野中，通过对精液上、中、下三层液面精子活动情况综合观察，评定精子活率。(2)取一滴解冻后的精液滴在干净的载玻片上，用另一载玻片呈45度，将精液抹向另一侧，制成抹片。自然风干后用I 2毫升福尔马林磷酸盐缓冲液固定15分钟，水洗干燥后用姬姆萨染色90分钟，然后除去抹片上的染液，风干后置于1000倍生物显微镜下观察500个精子，记录精子总数和顶体完整精子数，最后得到顶体完整率。
以下是发明人给出的具体试验实施例，试验选用体质健壮、性欲旺盛的成年荷斯坦种公牛，按种公牛饲养管理要求进行饲养，其采精频率为每周3次。利用假阴道采集法采集公牛精液，精液采集后，立即在35°C 37°C下镜检。所采集的精液为乳白色或乳黄色，无异味，精子形态正常，活率达到O. 7以上方可用于制作冷冻精液。试验按照不申请的技术方案设置了三个不同配方，并和传统配方进行了比较。配方I :配制100毫升冷冻稀释液柠檬酸钠O. 9毫克，蔗糖3. 3毫克，低密度脂蛋白16晕克,甘油5晕升,维生素E 500晕克,维生素B12IOO晕克,壮观霉素O. 35晕克,庆大霉素8万单位(IU)。配方2 :配制100毫升冷冻稀释液柠檬酸钠I. O毫克，蔗糖4. 3毫克，低密度脂蛋白17晕克,甘油6晕升,维生素E 600晕克,维生素B12150晕克,壮观霉素O. 35晕克,庆大霉素8万单位(IU)。配方3 :配制100毫升冷冻稀释液柠檬酸钠I. I毫克，蔗糖5. 3毫克，低密度脂蛋·白18晕克,维生素E 700晕克,维生素B12 200晕克；甘油7晕升,壮观霉素O. 35晕克,庆大霉素8万单位(IU)。传统配方配制100毫升稀释液柠檬酸钠I. 2毫克，蔗糖6. 3毫克，卵黄20毫升，甘油5晕升,壮观霉素O. 35晕克，庆大霉素8万单位(IU)。严格按以上配方称取称取所含成分，加蒸馏水至100毫升。在磁力搅拌器上搅动60分钟充分搅拌均匀，然后放入4°C冰箱过夜。精液稀释前加入壮观霉素O. 35毫克，庆大霉素8万单位(IU)并搅拌10分钟。用酸或碱调整稀释液的酸碱度，用PH计测定稀释液PH在6. 7 7. 2之间。用O. 22微米滤器对稀释液进行虑菌处理，完毕后放入37. 5°C水浴锅中备用。然后按照性控精液制作方法进行制作即可，解冻后用精子自动分析仪检测精液品质，具体指标见下表不同配方冷冻精液稀释液对冻融后X精子品质的影响(平均数土标准差)
权利要求
1.一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，其特征在于，制得的该冷冻稀释液每100毫升中含有以下物质 柠檬酸钠0. 9 I. 2克，蔗糖3 6克，低密度脂蛋白16-18毫克，甘油4 7毫升，维生素E 500毫克 700毫克，维生素B12 100毫克 200毫克，壮观霉素0. 35毫克，庆大霉素-J 8万单位(IU)，蒸馏水补足100毫升。
2.如权利要求I所述的用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，其特征在于，制得的该冷冻稀释液每100毫升中含有以下物质 柠檬酸钠1. 073毫克，蔗糖4. 3毫克，低密度脂蛋白16毫克，甘油6毫升，维生素E 600毫克，维生素B12 150毫克，壮观霉素0. 35毫克，庆大霉素8万单位(IU)，蒸馏水补足100晕升。
3.权利要求I或2所述的用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液的配制方法，其特征在于，按下列步骤进行 1)准确称取配方量的柠檬酸钠、蔗糖、低密度脂蛋白、维生素E、维生素B12和甘油，加蒸馏水至100毫升，在磁力搅拌器上搅动60分钟充分搅拌均匀，然后放入4°C冰箱过夜； 2)精液稀释前加入壮观霉素和庆大霉素并搅拌10分钟，用酸或碱调整稀释液的酸碱度，用PH计测定稀释液的pH在6. 5 7. 5之间，然后用O. 22微米滤器对稀释液进行虑菌处理，虑菌处理后放入37. 5°C水浴锅中备用。
全文摘要
本发明公开了一种用于提高荷斯坦公牛X精子冻后品质的冷冻稀释液，该冷冻稀释液每100毫升中含有以下物质柠檬酸钠0.9～1.2克，蔗糖3～6克，低密度脂蛋白16-18毫克，甘油4～7毫升，维生素E500毫克～700毫克，维生素B12100毫克～200毫克，壮观霉素0.35毫克，庆大霉素7～8万单位(IU)，蒸馏水补足100毫升。实验数据表明，该冷冻稀释液提高了X精子冻融后的活力和精子顶体完整率，提高了精子冻后品质。
文档编号A01N1/02GK102907417SQ20121040535
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月22日 优先权日2012年10月22日
发明者赵宪林, 昝林森, 胡建宏, 田万强, 王韦华, 郝瑞杰, 桂林生 申请人:西北农林科技大学