专利名称：高效诱导小麦-冰草异源染色体易位的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效诱导小麦-冰草异源染色体易位的方法。
背景技术：
小麦是世界第一大粮食作物，在中国是仅次于水稻的第二大粮食作物，在粮食安全中起着重要的作用。世界人口的增加和耕地面积的减少对小麦产量的要求越来越高。但是，近年来小麦品种的亲缘关系单一化，种内遗传变异急剧减少，致使栽培品种内的基因资源越来越贫乏，抗病抗旱能力越来越低。遗传基础狭窄已成为小麦育种的主要障碍，向小麦 中导入外源基因是拓宽小麦遗传基础的主要方法。小麦野生近缘植物遗传多样性丰富，具有许多栽培小麦所不具备的优良性状，如抗病、抗逆、耐瘠薄、高营养、高蛋白和大穗多花多粒等。因此，野生近缘植物优异基因对小麦遗传改良具有重要的意义。创制异源易位系是将外源基因整合到小麦染色体组的有效途径。小麦与野生近缘种之间的染色体易位通常以双二倍体、异附加系和异代换系为材料，诱导方法主要有远缘杂交、辐射、Ph基因突变体、组织培养和杀配子染色体等。就产生的易位频率而言，远缘杂交、Ph基因突变体和组织培养等方法诱导易位系的频率是很低的，一般都在1%以下；利用杀配子染色体和辐射诱导染色体易位的产生频率，均未超过10%。刘伟华等利用杀配子诱导小麦-冰草产生染色体易位的频率为3. 75% (Wei-Hua Liu, Yang Luan etal, Prooduction and Identification of Wheat-Agropyron cristatum(l. 4P)alientranslation lines [J]. Genome, 2010, 53:472-481)；王献平利用杀配子 3C 染色体诱导滨麦染色体易位的频率是5. 08% (王献平，初敬华，张相岐.小麦异源易位系的高效诱导和分子细胞遗传学鉴定[J].遗产学报，2003，30 (7) :619-624) ;Endo等对3C附加系与小黑麦1B/1R代换系杂种F2植株的检测结果表明，IR染色体易位频率为9.6% (EndoT R, Yamamoto M, Mukai Y. Structural changes of rye chromosome IR induced byagametocidal chromosome [J]. JpnJ Genet, 1994，69:13-19)。而 Friebe 等利用杀配子在黑麦染色体上获得的易位频率只有O. 6%(Friebe B, Kynast R G1Gill B S. Gametocidalfactor induced structural rearrangements in rye chromosomes added to commonwheat [J] · Chromosome Res, 2000，8:501-511) 0栾洋等利用射线照射杂交种和花粉产生的易位频率分别为 2. 78% 和 2. 12% (Yuan Luan, XiaoGuang Wang et al. Productionand identification of wheat-Agropyron cristatum 6P translocation lines[J].Planta, 2010, 232:501-510);王献平等将辐射后的小麦-中间偃麦草附加系花粉授于普通小麦，杂交后代中产生的易位株频率为2. 90%(王献平，初敬华，张相岐.小麦异源易位系的高效诱导和分子细胞遗传学鉴定[J].遗产学报，2003, 30(7) :619-624).以附加系为工具材料进行异源染色体易位的诱导，其诱导频率大多低于10%。综上所述，异源易位染色体的诱导频率较低，限制了小麦近缘野生植物优异基因的转移和利用效率，迫切需要建立一种高效诱导小麦外源染色体易位的方法。冰草属(Agropyron Gaertn.)是小麦族中含单一 P基因组的重要野生近缘属，含有许多高产特性，如分蘖能力强，多花多小穗，同时对旱、寒等非生物胁迫及白粉病、锈病等生物胁迫具有抗性。李立会等利用胚拯救的方法获得普通小麦(Triticum aestivum L.,2n=6x=42, AABBDD)与冰草(Agropyron cristatum(L. )Gaertn. 2n=4x=28, PPPP)属间杂种，通过自交或回交获得了一套稳定遗传的小麦-冰草异源二体异附加系(小麦-冰草异源附加系的创建· I. F3、F2BC1' BC4和BC3F1世代的细胞学·遗传学报，1997，24:154-159)。小麦-冰草异源二体异附加系的建立为将冰草P基因组优异基因转入小麦提供了可能。
发明内容
本发明的一个目的是提供用于诱导小麦-冰草异源染色体易位的受体材料的制备方法，包括种植小麦-冰草异源二体附加系的步骤，获得包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株即所述用于诱导小麦-冰草异源染色体易位的受体材料。小麦-冰草异源二体附加系为在普通小麦(2n=42)遗传背景下附加了一对冰草P染色体形成的染色体数目为2n=44的遗传材料。在上述方法中，所述小麦可为普通小麦(Triticum aestivum L.),具体可为普通小麦品种Fukuhokomugi ;所述冰草可为冰草属模式植物冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn. 2n=4X=28PPPP)，具体可为冰草居群 Z559。在上述方法中，所述小麦-冰草异源二体附加系为小麦-冰草附加系4844-12。·
本发明保护上述任一所述包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株在制备小麦-冰草异源染色体易位系中的应用。上述应用是以上述任一所述包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株作为辐照的受体材料。上述应用是采用6ciCo-Y射线以辐照剂量为20Gy和剂量率为O. 5Gy/min对上述任一所述包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株进行辐照。本发明还提供了一种用于获得小麦-冰草异源染色体易位系的材料的制备方法，是种植小麦-冰草异源二体附加系，获得包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株；然后采用6tlCo- Y射线以辐照剂量为20Gy和剂量率为O. 5Gy/min对所述包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株进行辐照，即得到用于获得小麦-冰草异源染色体易位系的材料。本发明的另一个目的是提供一种制备小麦-冰草异源染色体易位的方法，包括用60Co- Y射线辐照上述任一所述方法获得的受体材料即包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株，收获所述正在开放的花所结的种子，获得小麦与冰草染色体易位的所述小麦-冰草异源染色体易位系；所述辐照的辐照剂量为20Gy和剂量率为O. 5Gy/min。实验证明，用6tlCo-Y射线辐照(辐照剂量为20Gy和剂量率为O. 5Gy/min)包括正开放的小花在内的小麦-冰草附加系4844-12植株，由该小花所结的M1代种子产生的261株幼苗中，有104株发生了异源染色体易位，易位频率高达39. 85%，明显高于相同条件下辐照处于孕穗期的小穗和处于抽穗期未开花的小穗所结的M1代种子产生的幼苗的易位频率(分别为18. 45%和29. 31%)。本发明为拓宽小麦遗传基础，将冰草染色体中的有益基因转移到小麦提供了高效的途径，在基础理论研究和育种实际应用等方面均具有重要的意义。
图I为辐照小麦-冰草附加系4844-12正开放的小花的M1代幼苗的根尖细胞染色体荧光原位杂交显微照片。其中，图A为12-3整臂易位；图B为12-4大片段易位；图C为小片段易位+中间插入易位；图D为61-2-4大片段易位+小片段易位；箭头所指处为发生异源易位的染色体；P基因组(即冰草的基因组)DNA标记为红色信号。图2为辐照小麦-冰草附加系4844-12正开放的小花的M1代幼苗中发生异源易位的染色体。其中，A行和B行为含P染色体短臂的大小不同片段易位；C行和D行为含P染色体长臂的大小不同片段易位；E行为整臂易位；F行为中间插入易位；DAPI复染的小麦染色体片段为蓝色，P基因组探针信号为红色；PI复染的小麦染色体片段为红色，P基因组探针信号为黄绿色。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。小麦-冰草附加系4844-12 :小麦-冰草异源二体附加系，是普通小麦Fukuhokomugi和冰草Z559杂交F1经过6代自交制得的，基因组为AABBDD+6P II，2n=44,文献武军，王辉，刘伟华，李立会等.小麦新种质4844中外源P染色质的GISH与SSR分析.西北植物学报.2006, 26(6) : 1093-1097，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得。实施例I、用于诱导小麦-冰草异源染色体易位的受体材料的制备将小麦-冰草附加系4844-12的种子播种于含大田土壤的花盆(高30cm、盆口直径24cm)中，出苗后每盆定植3株，室外自然条件及正常水肥管理，获得包括正处于孕穗期的小穗、抽穗期尚未开花的小穗和/或正开放的小花在内的小麦-冰草附加系4844-12植株，即用于诱导小麦-冰草异源染色体易位的受体材料。实施例2、诱导小麦-冰草异源染色体易位取步骤一获得的包括正处于孕穗期的小穗(记为A)、抽穗期尚未开花的小穗(记为B)和/或正开放的小花(记为C)在内的小麦-冰草附加系4844-12植株共75株，分成三批(每批为一次重复)用6tlCo- Y射线进行辐照，辐照剂量为20Gy和剂量率为O. 5Gy/min，将经上述辐照过的受体材料(即用于获得小麦-冰草异源染色体易位系的材料)再移回室外自然条件进行正常水肥管理，按照辐照时期(A、B和C)分别收获成熟种子。从A、B和C三种处理所结的种子中分别随机取100粒，浸种后置于培养皿中，在温度23°C和16h/d光照条件下培养2天，根尖长至1-1. 5cm时，分别取单粒种子的根尖O. 5cm于0°C冰水中低温处理24h，以卡诺固定液(乙醇冰乙酸=3:1)固定48h，转至70%乙醇中保存，用于进行基因组原位杂交(GISH)和荧光显微镜检测，记录各单株的染色体易位情况并拍照，分别统计上述三种处理的易位频率[易位频率=(发生小麦-冰草异源染色体易位株数/检测株数)X 100%]，结果如表I所示，部分M1代幼苗根尖细胞的荧光显微镜照片如图I所示。将辐照小麦-冰草附加系4844-12中正开放的小花的M1代幼苗(261株)中发生异源易位的幼苗(104株，即小麦-冰草异源染色体易位系)的染色体进行归类，结果如图2所示。表I.不同时期小麦-冰草异源染色体易位频率统计结果
权利要求
1.用于诱导小麦-冰草异源染色体易位的受体材料的制备方法，包括种植小麦-冰草异源二体附加系的步骤，获得包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株即所述用于诱导小麦-冰草异源染色体易位的受体材料。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述小麦为普通小麦(Triticumaestivum L.)，所述冰草为冰草(Agropyron cristatum(L.) Gaertn.)。
3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于所述普通小麦(Triticumaestivum L.)为普通小麦品种 Fukuhokomugi ;所述冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)为居群Z559。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述小麦-冰草异源二体附加系为小麦-冰草附加系4844-12。
5.权利要求1-4中任一所述方法获得的包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株在制备小麦-冰草异源染色体易位系中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述应用是以所述包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株作为辐照的受体材料。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述应用是采用6tlCo-Y射线以辐照剂量为20Gy和剂量率为O. 5Gy/min对所述包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株进行辐照。
8.一种用于获得小麦-冰草异源染色体易位系的材料的制备方法，是种植小麦-冰草异源二体附加系，获得包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株；然后采用6tlCo-Y射线以辐照剂量为20Gy和剂量率为O. 5Gy/min对所述包括正在开放的花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株进行辐照，即得到用于获得小麦-冰草异源染色体易位系的材料。
9.一种制备小麦-冰草异源染色体易位系的方法，包括用6tlCo-Y射线辐照整株权利要求1-4中任一所述方法获得的受体材料，收获所述正在开放的花所结的种子，获得小麦与冰草染色体易位的所述小麦-冰草异源易位系；所述辐照的辐照剂量为20Gy和剂量率为O.5Gy/min。
全文摘要
本发明公开了一种高效诱导小麦-冰草异源染色体易位的方法。该方法是通过采用60Co-γ射线以辐照剂量为20Gy和剂量率为0.5Gy/min辐照包括正开放的小花在内的小麦-冰草异源二体附加系植株，获得易位频率明显提高(可达39.85%)的小麦-冰草异源易位系。本发明为拓宽小麦遗传基础，将冰草染色体中的有益基因转移到小麦提供了高效的途径，在基础理论研究和育种实际应用等方面均具有重要的意义。
文档编号A01H1/06GK102907316SQ20121042947
公开日2013年2月6日 申请日期2012年10月31日 优先权日2012年10月31日
发明者刘伟华, 李立会, 宋利强, 江莉莉, 高爱农, 杨欣明, 张锦鹏, 李秀全, 鲁玉清 申请人:中国农业科学院作物科学研究所