专利名称：利用<sup>60</sup>Co r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法
利用6°Co r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法技术领域
本发明属于植物辐射诱变处理技术领域，具体涉及一种利用6tlC0 r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法。
背景技术：
红叶石楠(Photiniafraser)是从光叶石楠(P. glabra)和石楠(P. serrulata)的杂交种中选育的新品种，属蔷薇科石楠属常绿小乔木，具有生长迅速，耐修剪，株形紧凑，萌芽力强，适用范围广等特点，成为一种观赏价值极高的园林植物。中国在20世纪90年代中期，从国外引种后开始进行大批量的速繁和推广。引入的优良品种也因长期扦插繁殖，易感染病害、虫害，叶片易脱落，观赏性下降，良种化程度降低。劣质种苗的使用又导致红叶石楠固有的优良特性日益丧失。因此，为了满足该产业对优良品种的需要，研究开发快速、高效的品种培育及育种材料创新技术具有重要意义。
在林木育种工作中，传统杂交育种是个非常漫长的过程，生物技术育种要获得优良品种一般也需要长达数年或数十年。辐射育种技术是利用射线诱发生物遗传性的改变， 并经人工选择培育新的优良品种的技术。该技术具有打破性状连锁、实现基因重组、突变频率高、突变类型多、变异性状稳定和方法简便等特点。目前，国内对红叶石楠的研究主要集中在组织快繁及工厂化育苗成套技术、扦插繁殖育苗技术、引种适应性和园林应用等方面 (杨静，2008 ;毕丽华，2011 ;方敏彦，2012 ；)。而国外，则主要集中在对不同品种生理特点和栽培繁殖技术的研究(Haynes，1991 ;Tokatli，2011)。经检索国内外至今尚未见有关利用 60Co r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种方法的相关研究报道。发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足，提供一种利用6tlCo !■射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法。
本发明所述利用6tlCo r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法，其特征在于 以在愈伤组织增殖培养基上暗培养获得的红叶石楠胚性愈伤组织为辐射材料，用辐照剂量为15-45Gy的6tlCo r射线辐射对其处理1_2小时，然后将辐射处理后的愈伤组织转到愈伤组织分化培养基上，在温度为25±2°C条件下暗培养30-35天，之后将暗培养后的红叶石楠材料转移到组培室光照条件下培养，温度为25 ± 2°C，光照为1500LX-1800LX，光照时间为 14-16h/d，15±2d后分化产生绿芽，绿芽先转到愈伤组织分化培养基上培养20±2d，转移到生根培养基上继续培育，直至得到完整红叶石楠组培苗即可移栽至大田种植；
其中
上述愈伤组织增殖培养基组成为改良MS+2，4_ 二氯苯氧乙酸(2，4_D)0. Img/ L+6-节基氨基嘌呤(BA) O. 5mg/L+ 萘乙酸(NAA) 20. Omg/L+phytagel 3. Og/L+ 鹿糖 20g/L ；
上述愈伤组织分化培养基组成为改良MS+6-苄基氨基嘌呤(BA) 2. Omg/ L+phytagel3. 5g/L+ 鹿糖 20g/L ；
上述生根培养基组成为1/2MS+吲哚丁酸(IBA) O. 2mg/L ；
上述各种培养基在高压灭菌前，调整pH值至5. 8。
上述的利用6tlCo r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法中所述6tlCo r射线辐射处理的辐照剂量优选设置为30Gy，处理时间优选设置为90分钟。
本发明以红叶石楠的胚性愈伤组织为材料，以6tlCo r射线为辐射源，研究了不同剂量的6tlCo r射线结合低温处理对愈伤组织生长、分化和植株再生的影响，运用离体培养方法从突变细胞再生出完整植株，建立了红叶石楠体细胞6tlCo r射线辐射诱变育种的方法。
本发明与现有技术相比具有如下优点和积极效果
I、本发明选用高频再生能力的胚性愈伤组织为材料，克服了现有技术经辐射诱变获得隐性突变体和嵌合体的缺陷，有利于得到诱变纯合体，提高辐射诱变效率，从而拓宽了红叶石楠种质资源，为高产、优质品种的选育奠定了基础。
2、本发明采用了辐射诱变处理技术，其中采用辐照剂量为30Gy的6tlCo !■射线处理 90分钟，愈伤组织绿芽分化率高达79%。
图I、对照(未辐射)分化绿芽。
图2、30Gy剂量辐射分化绿芽。
图3、对照(未辐射)再生植株移栽苗。
图4、30Gy剂量辐射再生植株移栽苗。
具体实施方式
实施例I
以试管苗第3到第6片展开叶为外植体，叶片带短叶柄，将叶片周围带锯齿状叶缘切去，叶片沿主脉切成左右2半，在叶片上轻划I刀，叶背朝下紧贴培养基放置，接种在改良 MS+2, 4-DO. lmg/L+BAO. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. Og/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈伤组织增殖培养基上，PH值5. 8，暗培养10d，诱导体胚性愈伤组织为辐射材料。
用辐射剂量为45Gy的6ciCor射线对上述辐射材料辐射处理60分钟，将辐射后的材料，转入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈伤组织分化培养基上，pH 值5. 8，在温度为25 ±2°C条件下继续暗培养30d，中间继代一次。
将上述培养材料转移到温度为25°C，光照为1500LX，光照时间为16h/d组培室条件下培养，约15d分化产生绿芽，绿芽转入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖愈伤组织分化培养基上培养20d。
将上述生长发育健壮的丛芽长到4cm切成单株转接到1/2MS+IBA O. 2mg/L生根培养基上，培养20d形成具有根、茎、叶的完整再生植株，即可炼苗移栽。
通过本发明方法获得的愈伤组织绿芽分化率为47%。
实施例2
以试管苗第3到第6片展开叶为外植体，叶片带短叶柄，将叶片周围带锯齿状叶缘切去，叶片沿主脉切成左右2半，在叶片上轻划I刀，叶背朝下紧贴培养基放置，接种在改良 MS+2, 4-DO. lmg/L+BAO. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. Og/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈伤组织增殖培养基上，PH值5. 8，暗培养10d，诱导体胚性愈伤组织为辐射材料。
用辐射剂量为30Gy的6°Co_r射线对辐射材料辐射处理90分钟，将辐射后的材料， 转入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈伤组织分化培养基上，pH值5.8，在温度为25°C条件下继续暗培养35d，中间继代一次。
将上述培养材料转移到温度为26°C，光照为1800LX，光照时间为16h/d组培室条件下培养，约15d分化产生绿芽，绿芽转入改良MS+2. Omg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖愈伤组织分化培养基上培养20d。
将上述生长发育健壮的丛芽长到4cm切成单株转接到1/2MS+IBA O. 2mg/L生根培养基上，培养15d形成具有根、茎、叶的完整再生植株，即可炼苗移栽。
通过本发明方法获得的愈伤组织绿芽分化率为79%。
实施例3
以试管苗第3到第6片展开叶为外植体，叶片带短叶柄，将叶片周围带锯齿状叶缘切去，叶片沿主脉切成左右2半，在叶片上轻划I刀，叶背朝下紧贴培养基放置，接种在改良 MS+2, 4-DO. lmg/L+BAO. 5mg/L+NAA20. Omg/L+3. Og/L phytagel+20g/L 鹿糖胚性愈伤组织增殖培养基上，pH值5. 8，暗培养10d，诱导体胚性愈伤组织为辐射材料。
用辐射剂量为15Gy的6tlCor射线对辐射材料辐射处理120分钟，将辐射后的材料， 转入改良MS+2. 0mg/L BA+3. 5g/L phytagel+20g/L蔗糖胚性愈伤组织分化培养基上，pH值5.8，之后在温度为25°C条件下继续暗培养40d，中间继代一次。
将上述培养材料转移到温度为27°C，光照为2000LX，光照时间为14h/d组培室条件下培养，约15d分化产生绿芽，绿芽转入改良MS+2. 0mg/L BA+3. 5g/Lphytagel+20g/L蔗糖愈伤组织分化培养基上培养20d。
将上述生长发育健壮的丛芽长到4cm切成单株转接到1/2MS+IBA 0. 2mg/L生根培养基上，培养20d形成具有根、茎、叶的完整再生植株，即可炼苗移栽。
通过本发明方法获得的愈伤组织绿芽分化率为67%。
本发明所述改良MS培养基成分为
权利要求
1.一种利用6tlCo r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法，其特征在于以在愈伤组织增殖培养基上暗培养获得的红叶石楠胚性愈伤组织为辐射材料，用辐照剂量为 15-45Gy的6tlCo r射线辐射对其处理1_2小时，然后将辐射处理后的愈伤组织转到愈伤组织分化培养基上，在温度为25±2°C条件下暗培养30-35天，之后将暗培养后的红叶石楠材料转移到组培室光照条件下培养，温度为25 ± 2 °C，光照为1500LX-1800LX，光照时间为 14-16h/d，15±2d后分化产生绿芽，绿芽先转到愈伤组织分化培养基上培养20±2d，转移到生根培养基上继续培育，直至得到完整红叶石楠组培苗即可移栽至大田种植；其中上述愈伤组织增殖培养基组成为改良MS+2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D) O. lmg/L+6-苄基氨基嘌呤(BA) O. 5mg/L+ 萘乙酸(NAA) 20. Omg/L+phytagel 3. Og/L+ 鹿糖 20g/L ；上述愈伤组织分化培养基组成为改良MS+6-苄基氨基嘌呤(BA) 2. Omg/ L+phytagel3. 5g/L+ 鹿糖 20g/L ；上述生根培养基组成为1/2MS+吲哚丁酸(IBA) O. 2mg/L ；上述各种培养基在高压灭菌前，调整PH值至5. 8。
2.根据权利要求I所述的利用6tlCor射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法，其特征在于所述6tlCo r射线辐射处理的辐照剂量设置为30Gy，处理时间设置为90分钟。
全文摘要
本发明公开了一种利用60Co r射线辐射诱变红叶石楠体细胞育种的方法，是以在愈伤组织增殖培养基上暗培养获得的红叶石楠胚性愈伤组织为辐射材料，用辐照剂量为15-45Gy的60Co r射线辐射对其处理1-2小时，然后将辐射处理后的愈伤组织转到愈伤组织分化培养基上，在温度为25±2℃条件下暗培养30-35天，之后转移到组培室光照条件下培养，愈伤组织绿芽分化率高达79%，由辐射诱变筛选的细胞再生出植株。本发明适宜用于植物新品种选育，为在细胞水平上开展植物体细胞突变体育种提供条件。
文档编号A01H4/00GK102934613SQ20121050042
公开日2013年2月20日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者燕丽萍, 梁慧敏, 夏阳, 刘翠兰, 毛秀红, 孙超 申请人:山东省林业科学研究院, 江苏农林职业技术学院