专利名称：一个控制水稻叶片形态和根毛发育的基因及其应用的制作方法
一个控制水稻叶片形态和根毛发育的基因及其应用技术领域
本发明属于植物分子生物学技术领域。
背景技术：
水稻叶片是进行光合作用的主要器官，其形态特征直接影响水稻的株型，进而影响水稻的产量和品质。本研究在以籼稻9311为背景的突变体库中筛选到一个动态窄叶突变体(dynamic narrowleaf 1，dnll)。采用图位克隆策略,克隆了 DNLl基因，获得了该基因在突变体中的编码序列。该基因的克隆和功能分析在籼型水稻中是首次报道，为人们理解水稻叶片的调控机理进而用于指导育种奠定了重要基础。
Aux/IAA基因是最早发现的生长素原初响应基因之一，其编码的蛋白在体内存在的时间很短，并且蛋白的降解受到生长素的调节。结构分析表明，Aux/IAA蛋白由四个高度保守的结构域组成，其中结构域II与蛋白的稳定性有关，结构域I、ΠΙ和IV与二聚化有关。 Aux/IAA蛋白没有与基因互作的区域，因此它是通过与生长素反应因子(ARF)结合形成异源二聚体来间接地发挥转录调节功能=ARF蛋白的结构域I可以与下游的生长素响应基因的启动子序列结合调节转录，而当Aux/IAA蛋白与ARF蛋白结合形成二聚体时，ARF蛋白就不能与下游生长素响应基因的启动子序列结合了，从而影响了下游生长素响应基因的转录。当Aux/IAA蛋白在生长素的诱导下被降解后，ARF蛋白就被释放出来了。到目前为止， 还没有发现Aux/IAA基因在水稻叶片发育中功能和调控机制。发明内容
本发明克隆了一个水稻新基因DNL1，阐明该基因功能不仅有重要的理论意义还有实际应用价值。
籼稻品种9311通过福照获得动态窄叶突变体dnll(dynamic narrow leafl),本发明利用该突变体与粳稻品种武运粳8号杂交配置F2群体，采用图位克隆的方法分离了 DNLl 基因，其序列如SEQ ID NO，I所示，根据RGAP网站的基因预测结果，该基因编码Aux/IAA蛋白，控制水稻叶片的极性发育和根部的形态建成。荧光定量RT-PCR结果表明，DNLl基因的表达量，与在突变体窄叶中相比，在突变体正常叶中极显著地下降了，可能存在反馈调节作用。
本发明所克隆的DNLl基因变异后，播种后长出的叶片宽度正常，分蘖期时开始长出极窄的叶片，而最后1-2张叶片的宽度恢复正常。分蘖期叶片变窄有利于田间通风透光， 到后期叶片恢复正常又可以为灌浆提供充足的光合作用产物。根部性状表现为根毛数量明显变少。
利用基因工程方法改变该基因或其编码的蛋白质序列可培育水稻动态窄叶新种质。因此，利用该基因在高产水稻的培育方面具有重要的应用价值。
图1不同时期叶片的表型。图2根部表型。图3是dnll初步定位结果。图4是dnll精细定位结果。图5是Real-time-PCR分析DNL1基因的表达情况。
具体实施例方式籼稻品种9311 :公开材料，江苏里下河地区农业科学研究院提供武运粳8号公开材料，江苏(武进)水稻研究所提供武育粳7号公开材料，江苏(武进)水稻研究所提供pCAMBIA1301_ubi :公开材料，该载体购自Takara公司农杆菌EHA105 :公开材料，该载体购自Takara公司。1基因的初步定位利用约400对SSR标记对dnll和武运粳8号进行多态性分析，其中揭示两亲本多 态性的标记有103对，用这103对标记对dnll和武运粳8号杂交产生的F2群体中10株典 型动态窄叶单株组成的小群体作连锁分析，由于群体偏分离，所以同时用20株正常表型单 株作为对照验证定位结果的准确性，结果发现第1染色体上的微卫星标记觀9、RM302与动 态窄叶性状表现连锁，而正常株交换甚多，判定该基因位于这两个标记附近。进而利用第1 染色体上在两亲本间表现出多态的SSR及STS (先前设计)标记对F2群体的94株动态窄叶 植株进行分析。用MAPMAKEER3. 0软件构建DNL1基因所在的区域的连锁群，将DNL1基因初 步定位在STS标记dl5和d20之间，与两标记的遗传距离分别为0. 9cM和2. 2cM，与STS标 记dl7表现共分离。(图3)2DNL1基因的精细定位目标基因的精细定位是进行基因图位克隆的关键，与目标基因紧密连锁的分子标 记的确定将为构建覆盖该基因的物理图谱奠定基础。为了进一步精细定位DNL1，一方面继 续扩大定位群体，将dnllX武育粳7号衍生的F2群体中分离出来的45个隐性单株与用于 基因初步定位的94个隐性单株混合，共139个隐性单株用于基因的精细定位。另一方面在 目标基因所在的区段发展更多的STS标记。本研究中，在RM9和RM302之间发展了 49个 STS标记，将这些标记对亲本进行多态性分析，其中15个标记在亲本间表现出多态性。进 一步利用这15个标记对两个F2群体(dnllX武运粳8号、dnllX武育粳7号)中的动态 窄叶单株进行标记基因型分析，发现分子标记M1-Z49，M1-Z41，M1-Z43和dl7与dnll共分 离，没有交换单株出现；而在M1-Z47和M1-Z42两个标记座位上分别存在1个和2个交换 事件，因此，我们将Dnll基因限定在M1-Z47与M1-Z42之间。这两个标记所在PAC分别为 AP002972和AP003768，据此我们构建了覆盖Dnll基因的物理图谱，成功地将Dnll基因限 定在约172kb的范围内。在此基础上，利用dnll/武运粳8号F3群体(dnll和武运粳8号杂交产生的F2群 体自交所得)中的500株正常单株对DNL1进行了进一步的精细定位，并在M1-Z47和M1-Z42 之间发展新标记。结果，M1-Z40、M1-Z43与DNL1表现共分离，因而将DNL1定位在M1-Z40 和M1-Z43之间，它们相距约20kb，以此构建了覆盖窄叶基因DNL1的物理图谱(图4)。
3基因预测及序列测定
根据RGAP网站的基因预测结果，在DNLl所在的20kb的定位区段上仅存在一个生长素响应的基因。对该突变体和野生型品种的这个基因测序分析，发现在dnll的三个内含子发生单碱基替换:T —C，T —A，A —T (分别位于AP003768 :27596、27696、28018处)， 一个外显子发生了单碱基替换A —G (位于AP003768:28808处)。并且在启动子序列发生一个单碱基替换G —C和两个碱基的插入AT。测序结果进一步证实了突变基因的性质， 因此将该基因初步定为DNLl的候选基因。
4DNL1基因的表达分析
可能存在反馈调节作用。本研究通过Real-time PCR技术检测了 DNLl基因在变体窄叶、突变体正常叶和9311叶片中的表达情况，发现与在9311叶片中相比，在突变体窄叶中表达量无显著变化，但在突变体正常叶中显著地下降了，表明突变体植株内可能存在反馈调节作用(图5)。
权利要求
1.一个控制水稻叶片形态和根毛发育的基因ftVZ7，其特征在于该基因的序列如SEQ ID NO: I所示。
2.权利要求I所述基因在控制水稻叶片形态和根毛发育中的用途。
全文摘要
本发明属于植物分子生物学技术领域。具体涉及一个控制水稻叶片形态和根毛发育的基因DNL1，该基因的序列如SEQ ID NO:1所示。该基因或其编码的蛋白质序列可培育水稻动态窄叶新种质；在高产水稻的培育方面具有重要的应用价值。
文档编号A01H5/00GK102936599SQ201210521609
公开日2013年2月20日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者严长杰, 郭旻, 李传友, 曾生元 申请人:扬州大学