专利名称：一种与致病力相关的灰葡萄孢新基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物病害防治领域，具体地，本发明涉及一种与灰葡萄孢致病力相关Bcdpl基因。本发明还涉及该基因在植物病害防治中的应用以及作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
背景技术：
灰葡萄孢(Soizyii1S ciflerea)属半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、葡萄孢属，它是最早被研究的真菌之一。该菌菌丝有隔膜，有性繁殖的方式主要为异宗配合，自然条件下几乎不产生子囊孢子。分生孢子梗多为褐色、直立、有分隔大小为96(Tl 200 MfflX 16 Mm,顶端具不规则树状分支分枝，顶端稍膨大，呈棒头状，其上着生大量的分生孢子，分生孢子聚集成葡萄穗状。分生孢子呈圆形或卵形，颜色为淡灰色、灰白色或无色，其大小为8 14MfflX 6^9 Mm。灰葡萄孢在培养基上培养I周后，会产生菌核，菌核呈灰黑色或黑色，形状呈片状、圆形、不规则形，大小约小21 ππιιΧΓ3 mm ;剖开菌核观察其组织，外部为疏丝组织，内部为拟薄璧组织且有大量分生孢子。灰霉病由灰葡萄孢侵染所致，属真菌病害，它能危害番茄、黄瓜、草莓、辣椒、葡萄等多种蔬菜、果树和观赏植物，目前已发现的寄主植物至少有235种，且花、果、叶、茎均可发病。寄主植株从苗期到挂果期都可以发病，叶、茎、花、果实均可感染病害。感病后，叶部症状表现有“V”形病斑、不规则病斑、叶柄折断等症状。茎部症状表现为茎腐烂、茎基腐烂。花部症状表现为花腐烂和凋萎。果实症状表现为腐烂和果实脱落。病害发生、蔓延与湿度和温度有十分密切的关系。近年来，灰霉病的发生日益严重，给国民经济带来严重影响。目前对于灰霉病的防治仍以化学防治、为主，但由于灰葡萄孢很容易产生抗药性，而且大量使用化学药剂所造成的农药残留、环境污染等诸多问题日益严重，如何利用新的环保的方法有效防治病害成为当前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的灰葡萄孢致病基因，所述基因在灰葡萄孢致病过程中起重要作用，且可使用该基因在植物病害防治的靶标药物中的应用。本发明前期借助农杆菌AGL-I (其中带有双元载体质粒pBHtl)构建了灰葡萄孢ATMT突变体库。通过筛选该突变体库，获得了大量的分生孢子形态、产孢量、菌核的有无及致病性方面发生明显变化的突变体。进一步本发明利用离体果实接种法，从灰葡萄孢ATMT突变体库中筛选获得了一株致病力丧失的突变体Bct89。对突变体的表型分析，发现该突变体Bct89的生长速度缓慢、不产生菌核和分生孢子；显微观察发现，该菌株菌丝隔变短、变细，且颜色较野生型明显变浅。进一步本发明利用TAIL-PCR技术，获得了致病力丧失突变体Bct89的侧翼序列。生物信息学方法确定了突变基因为BC1G_10703. I (,Botrytis cinerea pathogenicdeficient related, Bcdpl),如SEQ No. I所示，且T-DNA的插入位点位于该基因的第3个外显子上。生物信息学分析发现该基因为一未知功能新基因。利用PCR技术，进一步确定了 T-DNA插入到了斯办7基因的第3个外显子上；通过Southern blotting技术,确定了T-DNA是以单拷贝的形式插入到突变体Bct89的基因组中；利用RT-PCR技术，进一步确定了突变体Bct89中Bcdpl基因被突变。推测沒《//77基因参与灰葡萄孢的致病性、分生孢子发育和菌核的形成。进一步本发明对细胞壁降解酶及毒素活性分析，发现突变体Bct89的细胞壁降解酶类纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)、果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)、多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果胶甲基反式消除酶(PMTE)的酶活性较野生型明显降低，而毒素活性较与野生型相比差异不显著。利用RT-PCR技术，检测突变体Bct89中抗病相关基因的表达情况，发现初步ifc办7基因突变影响胞壁降解酶基因、产毒基因、信号途径相关基因的表达。推测ifc办7基因是通过影响灰葡萄孢的细胞壁降解酶、毒素活性及致病相关基因的表达等因素影响其致病力。
更进一步本发明成功构建了 ifc办7基因的同源重组载体，利用PEG介导的原生质体转化技术转化灰葡萄孢野生型菌株，利用潮霉素B筛选获得了 10株转化子。通过PCR、RT-PCR和Southern blotting技术验证转化子,试验结果表明本课题组已经成功获得了Bcdpl基因的T-DNA插入突变体和敲除突变体」Bcdpl。并采用活体和离体果实、叶片接种的方法对突变体进行致病力测定，发现』Bcdpl和Bct89突变体均丧失了致病能力，明确了本发明所述Bcdpl基因为灰葡萄孢致病相关基因。进一步本发明提供了所述基因作为植物病害防治的药物的靶标的应用，所述植物病害是由灰葡萄孢导致的灰霉病。发明还提供了所述基因作为一种治疗由灰葡萄孢导致的植物灰霉病的方法，包含阻断或抑制灰葡萄孢中ifc办7基因的表达。此外，本发明还提供了所述基因在作为阻断或抑制基因的表达的药剂中的应用。
图I灰葡萄孢ATMT突变体库的构建图 图2转化子的PCR验证图
1-10，不同 ATMT 转化子；W，对照；M, DL2000 maker。图3转化子的southern blot验证图
1-7,不同 ATMT 转化子；W，对照；M, Southern maker。图4致病力丧失菌株BCt89的筛选及显微观察图 图5致病力丧失菌株BCt89遗传稳定性观察图
T5，5代;Τ10，第10代;Τ15，第15代;M_N，BCt89针刺接种;WT_N，野生型针刺接种；M-C, BCt89未针刺接种；WT-C，BCt89未针刺接种。图6致病力丧失菌株BCt89的表型观察图 图7突变体BCt89的突变基因的确定
A，基因结构图；B，PCR验证I引物P1&P2 2引物P2&P3 3引物P3&P4;
C，southern 验证 1，WT 2，BCt89 Hind III 酶切 3，BCt89 EcoRI 酶切图8突变体BCt89的致病因子比较分析(细胞壁降解酶酶活力)
PMG，果胶甲基半乳糖醛酸酶；PG，多聚半乳糖醛酸酶；Cx纤维素酶；PMTE，果胶甲基反式消除酶；PGTE，多聚半乳糖醛酸反式消除酶
图9突变体BCt89的致病因子比较分析(次生代谢产物)
图10 Bcdpl基因的同源重组载体的构建及转化子的PCR和RT-PCR鉴定A, B Δ Bcdpl突变体PCR验证；C,敲除载体构建示意图D, Southern验证敲除转化子WT，野生型，1-4为敲除转化子；E，RT-PCR验证敲除转化子
图WABcdpl突变体和ATMT突变株Bct89的致病力观察图 注“ -N”标注为针刺接种，其余为未针刺对照。图12 Z Bcdpl突变体和ATMT突变株Bct89的组织病理学观察图
具体实施例方式下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。实施例I Bcdpl基因T-DNA插入突变体的获得
本发明所涉及的突变体是通过根癌农杆菌介导的转化法(ATMT)获得的。I. I农杆菌的培养。挑取农杆菌单菌落于LB液体培养基(含50 yg/mL卡那霉素及50 μ g/mL利福平)中，28°C 120 rpm下摇培48 h,取I mL菌液于4°C 10000 rpm下离心I min，弃上清。用诱导培养基(頂)洗2次，并用頂培养基稀释至0D600 ^ O. 15，加入终浓度为200 400 μ M的AS，然后28°C 180 rpm下活化约7 h。I. 2灰葡萄孢分生孢子的收集。用10 mL灭菌蒸馏水从培养大约7 d的PDA平板上洗下灰葡萄孢的分生孢子，两层纱布过滤后用血球计数板计数，并用无菌水稀释孢子浓度为105个/mL。I. 3农杆菌与灰葡萄孢孢子共培养及转化子筛选。取100 μ L培养好的农杆菌AGL-I (含载体)菌液和100 μ L稀释好的灰葡萄孢分生孢子悬浮液混合，混合液(200 μ L)均匀涂于CM平板的玻璃纸上，20°C培养48 h。然后将玻璃纸膜转移到涂于含有潮霉素B(50 μ g/mL)、羧苄青霉素和头孢噻肟钠(各200 μ g/mL)的PDA培养基上，将平皿置于20°C下培养到转化子出现。将转化子接种到含100 μ g/mL潮霉素的PDA平板上再次鉴定。I. 4转化子的纯化及保存。按上述方法获得的转化子转接到试管PDA斜面培养基上在黑暗下培养7 10天后置于4°C保存。实施例2致病力丧失突变体的筛选及稳定性检测
利用果实离体接种法对灰葡萄孢T-DNA插入突变体库进行筛选。先选取大小一致的新鲜番茄用75%酒精擦洗果实进行表面消毒。同时，将复壮后的灰葡萄孢野生型BC22、转化子培养3 d，分别用打孔器从菌落边缘打取直径5 _的菌盘，对称接种于番茄果实(无伤口)，将接种后的番茄果实放入保湿缸中，6 d后调查病情。根据病斑面积大小评定菌株致病力差异。将筛选得到的灰葡萄孢致病力丧失的突变体Bct89在PDA培养基中继代培养15代(含有潮霉素100 μ g/mL)，并将各代进行致病力测定，观察其致病稳定性，方法同上。实施例3突变体的生物学研究
将灰葡萄孢野生型菌株BC22、突变体菌株Bct89进行复壮，复壮后分别将其接种于PDA培养基上，培养3 d后，分别于菌落边缘打孔直径9 mm的野生型、突变体菌盘，20°C培养10d，观察菌落形态、颜色，测量生长速度，产孢量等。
实施例4分析T-DNA在突变体菌株Bct89基因组中的插入部位
利用TAIL-PCR技术获得T-DNA在突变体菌株Bct89基因组中的插入部位。T-DNA左右边界嵌套引物、随机引物的合成及PCR程序参照Mullins等的方法。实施例5突变体的PCR、Southern blotting鉴定 4.I转化子PCR鉴定
根据T-DNA中潮霉素磷酸转移酶基因设计引物，利用PCR技术对灰葡萄孢转化子DNA进行扩增。试验所需引物见表I。表I试验所需引物 _
权利要求
1.一种来自灰葡萄孢cinerea)的基因斯办7，其核苷酸序列如SEQ IDNo. I所示。
2.由SEQID No. I所编码的氨基酸序列，如SEQ ID No. 2所示。
3.权利要求I所述的基因在防治由灰葡萄孢导致的灰霉病中的应用。
4.权利要求I所述的基因作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用，所述植物病害是由灰葡萄孢导致的灰霉病。
5.一种治疗由灰葡萄孢导致的植物灰霉病的方法，包含阻断或抑制灰葡萄孢中BcPDRl基因的表达。
6.阻断或抑制权利要求I所述基因的表达的药剂在制备药物中的应用，所述药剂是权利要求I所述基因的反义RNA或siRNA，所述药物用于控制由灰葡萄孢导致的植物灰霉病。
全文摘要
本发明涉及一种灰葡萄孢基因，命名为Bcdp1，该基因含有3个外显子和2个内含子，DNA全长1608bp，cDNA全长597bp，编码198个氨基酸。本发明还涉及含有该基因的表达载体和宿主以及该基因在植物病害(特别是灰霉病)防治中的应用以及作为用于植物病害防治的药物的靶标的应用。
文档编号A01N61/00GK102965382SQ20121051980
公开日2013年3月13日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者邢继红, 董金皋, 王凤茹, 赵斌, 司贺龙, 郑会欣, 赵福鑫 申请人:河北农业大学