一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcUdc1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌分生孢子 萌发与致病性的基因及其编码蛋白质的应用。
【背景技术】
[0002] 灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门（Ascomycota) 真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、 挂果期到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表 现为"V"形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和 蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20°C_23°C，相对湿度90%以上时发生严重。因 此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病 导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分 子研究技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。
[0003] 灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包 括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等， 这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然 条件下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、 分生孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染 来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的 分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子 萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要 从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。
[0004] 当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形 成的附着胞侵入;伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓 1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将 会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防 御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望 成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因 子(如毒素)来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子 机制仍所知甚少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子， 不仅有助于揭示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可 以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理 论和技术基础。
[0005] Udcl是一种尿卟啉原脱羧酶，参与催化血红素合成途径的第五步反应。该蛋白广 泛存在于动物、植物、细菌、真菌等生物，由于血红素可以作为众多蛋白的辅基参与多种生 命过程，因此，作为催化血红素合成酶之一的Udcl蛋白具有重要的功能。在植物中，Udcl水 平下降会导致叶片出现坏死状的假病斑，并使其抗病性获得提高。Udcl蛋白在灰霉病菌中 同样存在，而且功能尚未获得鉴定，通过分析灰霉病菌Udcl编码基因的致病功能，评价该基 因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛选新型杀真菌 药剂。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的旨在提供一种控制分生孢子萌发和致病性的基因及其编码的蛋白 质。
[0007] 本发明所提供的控制分生孢子萌发和致病性基因来源于灰霉病菌，名称为 BcUdc 1，其DNA序列如SEQ ID No : 1所示。该DNA序列为BcUdc 1基因开放阅读框，由1323个核 苷酸组成，其中包含5个外显子，分别位于SEQ ID No: 1的5'端第1位至55位核苷酸之间、第 109位至150位核苷酸之间、第219位至754位核苷酸之间、第810位至1200位核苷酸之间和第 1253位至1323位核苷酸之间，组成的编码区长度合计为1095个核苷酸。
[0008] 本发明提供了BcUdcl基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，该 序列由364个氨基酸组成。
[0009] 来自灰霉病菌的控制分生孢子萌发和致病性基因 BcUdcl可应用于植物抗灰霉病 基因工程领域。
[0010] 对来自灰霉病菌的控制分生孢子萌发和致病性基因 BcUdcl所编码的蛋白质进行 缺失、突变或修饰，而使其分生孢子萌发、致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真 菌药剂中应用。
[0011] 本发明证明了 BcUdcl基因的缺失或突变，导致灰霉病菌分生孢子萌发缓慢及致病 力显著降低，说明BcUdcl基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够 阻止该基因表达与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从 而有助于开发新型杀菌剂，即本发明所提供的BcUdcl基因的一个重要用途是：该基因的表 达与其编码的蛋白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗真菌药 剂(特别是抗灰霉病菌药剂)的设计和筛选。
【附图说明】
[0012] 图1为各物种Udcl蛋白质系统发育树分析示意图 [0013]其中：三角号标记的为灰霉病菌；
[0014] 图2为灰霉病菌BcUdcl基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图
[0015] 其中：WT为野生型菌株B05.10，pUdcl-ko为敲除载体，BcUdcl-KO为BcUdcl基因缺 失突变体，a、b、c、d为用于验证突变体及互补菌株的引物；
[0016] 图3为BcUdcl基因缺失突变体及遗传互补菌株的PCR验证电泳图
[0017] 其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2;M1为BcUdcl基因缺失突变体;Ml/Udcl 为在突变体Ml基础上转入完整BcUdcl基因的互补菌株；
[0018]图4为BcUdcl基因的缺失突变体与野生型菌株的分生孢子萌发比较照片 [0019]其中：采用载玻片培养法，所用培养基为PDB;WT为野生型，Ml为BcUdcl基因缺失突 变体，Ml/Udcl为在突变体Ml基础上转入完整BcUdcl基因的互补菌株，标尺为20μπι ;
[0020]图5为BcUdcl基因的突变体与野生型菌株及互补菌株的致病力比较照片 [0021 ]其中：所选择寄主为番茄，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后进行评价； RIS菌株为敲除载体的T-DNA随机插入的转化子(BcUdcl基因完好，没有发生缺失），其它菌 株同上;箭头所示为病斑位置；
[0022]图6为BcUdcl基因的突变体与对照菌株侵染寄主后的生长量比较示意图
[0023] 其中：所选择寄主为番茄，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后对叶片表面 进行消毒，研磨后涂布至TOA平板上，培养2天后计数灰霉病菌菌落个数;CFU指菌落形成单 位;检测菌株同上。**表示在P〈〇. 01水平上差异显著。
【具体实施方式】
[0024] 为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例 中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0025]实施例lBcUdcl基因的相关性分析
[0026]灰霉病菌BcUdcl基因的开放阅读框由1323个核苷酸组成，包含5个外显子，编码区 cDNA全长为1095个核苷酸，编码的蛋白质产物由364个氨基酸组成。取BcUdcl蛋白质序列进 行比对分析(http://blast .ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现Udcl广泛存在于动物、植 物、真菌和细菌等细胞生物中。系统发育树分析(http://phylogeny. lirmm.fr/phylo_cgi/ simple_phylogeny .cgi)表明，丝状真菌Udcl蛋白质之间的同源性较高，其中BcUdcl与核盘 菌Udcl亲缘关系最近;BcUdcl与酵母稍远，接下来依次是动物、细菌，与绿藻及植物亲缘关 系最远(见图1)。
[0027] 实施例2BcUdcl基因的敲除与遗传互补
[0028] 1)敲除载体的构建
[0029] 采用引物Udc 1-UP-F (5，-CTCGAGGCTCCGTGGAAACACCTACA-3)，与Udc 1-UP-R(5 ' -GAATTCAAATAAGTTGACAGGGACGAGA-3 '），以灰霉病菌菌株B05.10的基因组