通用型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及血凝素基因 HA2,一种通用型抗禽流感重组乳 酸菌及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 禽流感是由禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的一种非常重要的传 染病。它不仅能对养禽业造成严重的经济损失，而且也严重威胁着人类的健康。目前为止， 疫苗是控制抗禽流感最为有效的手段。
[0003] 禽流感是由禽流感病毒(Avian Influenza Virus，AIV)引起的，可对禽养殖业造 成巨大经济损失的人畜共患病之一 JIV属正粘病毒，为单股负链分节段的RNA病毒，其基 因组包括?82、？81、?六、说、即、嫩、1和吧8个节段，能够编码11种蛋白。根据其表面糖蛋白不 同分为18个HA与11个NA亚型。目前，疫苗接种是防控禽流感的最有效措施之一，此方法主要 通过两种途径来抵抗禽流感:第一，成功接种疫苗之后可以减轻疾病的临床症状，能够降低 鼻腔及肺部的病理变化;第二，接种疫苗的动物与感染动物相比，病毒的滴度降低，从而降 低了病毒进一步传播的可能性。
[0004] HA是流感病毒表面主要的保护性抗原之一，能诱导机体产生中和抗体，含有多个 T/B细胞表位，HA蛋白是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，为I型糖蛋白，以同源三聚 体形式存在于病毒表面，它能够帮助病毒穿透宿主唾液酸之类的细胞受体，介导病毒的吸 附与穿膜，启动病毒感染过程，帮助病毒穿透宿主的细胞膜以及改变抗原性，从而逃脱宿主 的免疫监视。HA蛋白有四个结构域，是病毒表面最丰富的蛋白，具有高度的免疫原性，其单 体在翻译后会被宿主细胞内的蛋白裂解酶裂解成HA1和HA2两个亚单位，而位于C端的HA2形 成茎部结构锚定在病毒囊膜中，引起病毒囊膜与细胞膜的融合和病毒粒子核衣壳的释放， 含有高度保守的融合序列。所以基于HA2保守区域的通用疫苗研究一直是一个热点。
[0005] 乳酸菌(Lactobacillus)是可发酵碳水化合物生成大量乳酸的一类细菌的总称。 由于在人或动物体内长期定植，并且对机体产生益生作用，在国际上将他们认为是食品级 安全微生物。因具有容易培养、操作方便、安全无毒等诸多优势，在基因工程疫苗领域乳酸 菌是一种表达异源蛋白或作为活载体递呈抗原的重要工具。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种重组基因 HA2和一种重组乳酸菌。
[0007] 一种重组基因 HA2,其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一种重组基因 HA2质粒，是在pW425et上插入了重组基因 HA2,命名为pW425et-HA2。
[0009] 一种重组乳酸菌，是转化了一种重组基因 HA2质粒pW425et-HA2的乳酸杆菌。
[0010] 所述的乳酸杆菌为植物乳酸杆菌。
[0011] 通用型抗禽流感的重组乳酸菌的制备方法，它主要包括： (1)人工合成其碱基序列如序列表SEQ ID NO. 1所示的重组基因 HA2; (2) 将重组基因 HA2插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达载体pW425et中，构建大肠杆菌-乳 酸菌穿梭表达重组质粒pW425et-HA2; (3) 将重组质粒pW425et-HA2转化至乳酸杆菌中。
[0012] 本发明另一目的是一种重组乳酸菌在制备抗禽流感药物的应用。
[0013] -种重组乳酸菌在制备抗禽流感药物的应用。
[0014] 所述的禽流感为H9N2亚型和\或册吧亚型。
[0015] 本发明提供了一种通用型抗禽流感重组乳酸菌，它是利用禽流感病毒血凝素基因 HA2的高度保守性以及乳酸菌作为抗原递呈载体的安全性，利用分子生物学技术构建了表 达HA2基因的大肠杆菌-乳酸菌穿梭重组质粒pW425et-HA2,将重组质粒转化至乳酸杆菌中， 获得了抗多种亚型禽流感病毒的重组乳酸杆菌。该重组乳酸菌通过口服的方式进入消化道 定植后，表达的HA2蛋白在雏鸡肠道被抗原递呈细胞识别，有效地诱导机体产生血凝抑制抗 体和slgA，显著减少雏鸡的体重损失，有效预防不同亚型流感病毒的感染。经过大量增菌培 养后，首次免疫连续灌胃雏鸡3次，间隔2周后，加强免疫，连续灌服雏鸡3次，间隔2周后，分 别感染不同亚型流感病毒1次，观察保护效果。结果显示，与禽流感灭活疫苗相比，重组乳酸 杆菌可显著提高雏鸡体内的HA的特异性抗体以及肠内容物中slgA含量。本发明制备了通用 型抗禽流感的重组乳酸杆菌，制备方法和生产工艺相对简单，使用方式为饮水口服，便于规 模化生产和应用，具有广阔的应用前景和良好的经济社会效益。
【附图说明】
[0016] 图1 pGE- HA2酶切鉴定电泳结果； 图2 pW425et- HA2酶切鉴定电泳结果； 图3重组乳酸杆菌表达pW425et_HA2蛋白检测结果:Western-blot结果； 图4血凝抑制试验检测雏鸡血液中HA抗体(H9N2)滴度的变化； 图5血凝抑制试验检测雏鸡血液中HA抗体(H6N2)滴度的变化； 图6雏鸡血清中特异性IgG的变化； 图7雏鸡肠内容物中特异性slgA含量变化； 图8淋巴细胞增殖实验检测雏鸡脾脏淋巴细胞数量的变化； 图9雏鸡感染相同亚型的H9N2禽流感病毒后体重丢失情况； 图10雏鸡感染H6N2亚型禽流感病毒后体重丢失情况。
【具体实施方式】
[00Π ] 实施例1重组基因 HA2的获得 以Genbank公布的重组基因 HA2序列(KM245332.4)为模板，根据密码子的简并性和乳 酸菌表达蛋白对密码子的偏爱性，优化密码子后送往上海捷瑞生物工程有限公司合成，且 上下游加入Xbal和Hind ΙΠ 酶切位点。人工合成后的重组基因 HA2连接在pGE载体上，即 PGE-HA2，采用常规酶切技术，应用限制性内切酶Xbal和Hind ΙΠ 双酶切pGE-HA2，获得了大 小为690bp目的基因片段HA2,酶切体系如下所述。其碱基序列如序列表SEQ ID N0.1所示。
[0018]
反应条件:37°C水浴1 h。结束后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测显示，成功获得了基因 HA2,如图1所示。
[0019] 实施例2重组表达质粒pW425et-HA2的构建 采用Xbal和Hind ΙΠ 限制性内切酶分别对pGE-HA2和pW425et进行双酶切，以获得重组 基因 HA2和pW425et表达载体片段;双酶切体系和反应条件同实施例1中所述。试剂盒回收目 的基因后，采用T4 DNA连接酶进行连接。
[0020] 连接体系如下：
反应条件：16°c连接2h，4°C过夜;次日常规CaCl2法转化E.coli DH5a感受态，并筛选 重组阳性菌。
[0021] 质粒小量提取方法按照质粒小提试剂盒说明书操作提取，对质粒进行酶切鉴定， 结果表明成功构建了重组质粒pW425et-HA2，如图2所示。
[0022] 实施例3通用型抗禽流感的重组乳酸菌的制备及表达产物检测 (1)乳酸杆菌感受态细胞制备及转化 活化Lb.plantarum NC8菌种，将其单个菌落接种到含1 %甘氨酸的MRS液体培养基(不 含葡萄糖）中，30 °C条件下厌氧培养至OD600值为约0.6时，以2%的接种量接种到MRS液体培 养基中（含有1%甘氨酸），当厌氧培养到0D6QQ值约为0.3时，4 °C条件下4500 r/min离心5 min收集菌体(除了离心步骤以外，制备感受态过程中Lb.plantarum NC8-直放在冰水混合 物中）。使用预冷的电转化缓冲液悬浮洗涤2次后，将Lb.plantarum NC8悬浮于适量电击缓 冲液中，冰浴10 min，分装。Lb.plantarum NC8的感受态即可用于电转化。
[0023] 分别取1-2 yg的重组质粒pW425et-HA2与已经制备的150μΙ^/Κ冷的Lb.plantarum NC8受体菌细胞悬液混合，转入已经预冷的间距0.2 cm是电击杯中，冰浴10 min后用电转仪 电击，条件为2000 V，400 Ω，25 yF。电击结束后，将电击杯静止冰浴5 min。将电转化后的 混合液转移到离心管中，随后加入600 yL MRS液体培养基，在30 °C条件下厌氧培养2 h。取 120 yL电转化后的菌液，涂在MRS琼脂平板(含10 yg/mL红霉素）上，在30 °C条件下厌氧培 养18 h以上，直到能观察到单菌落为止，筛选阳性克隆子。
[0024] (2)重组乳酸杆菌中表达载体的鉴定 试剂盒提取阳性重组菌质粒，按照实施例2中所述，对质粒进行酶切鉴定，结果表明成 功制备了携带重组质粒pW425et-HA2的重组乳酸杆菌pW425et-HA2/NC8。
[0025] (3)重组乳酸杆菌pW425et-HA2 / NC8表达产物的鉴定 将重组乳酸菌pW425et-HA2/NC8接到含红霉素的MRS液体培养基中，30°C，厌氧条件下 培养约12 h，按照1 %体积接于新鲜的含红霉素的MRS液体培养基中，厌氧条件下培养8 h停 止，离心收集重组乳酸菌菌体，重组乳酸菌用PBS洗涤两次，200V超声lOmin，离心收集沉淀。 最后悬在50 yL PBS中，加上50 yL 2XSDS上样缓冲液和5 yL DTT煮沸10 min，-20°C保存 用于SDS-PAGE和Western blotting检测;Western-blot中所用的一抗是兔抗禽流感HA多 克隆抗体（使用TBST按1 :500稀释）、二抗是HRP标记的羊抗兔IgG(使用封闭液按1: 1500稀释），结果表明重组乳酸杆菌可稳定表达大小为66kDa的HA2蛋白，如图3所示。
[0026] 实施例4重组乳酸菌抗禽流感指标的检测 (1)动物分组及处理 刚出壳的海兰雄性雏鸡80只，购自长春市北方种鸡厂，未经任何免疫，饲养于严格消毒 的鸡笼中。饮水器和饲料槽等用具经严格的蒸煮消毒。饲料按肉雏鸡营养需要自行配制，未 添加任何抗生素及饲料添加剂。
[0027] 将4周龄雏鸡随机分为4组，每组20只，分别为roS免疫组、pW425et /NC8免疫组、 pW425et-HA2/NC8免疫组和H9N2亚型禽流感灭活苗免疫组，依次标记为A组、B组、C组、D组 (见表1)。免疫途径为口服免疫，免疫分