一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗，目的在于预 防埃博拉病毒病。本发明属于生物工程技术领域。
【背景技术】
[0002] 埃博拉病毒(Ebola virus，EB0V)属于丝状病毒科，可引起人和灵长类动物产生出 血热。1976年首次发现于苏丹南部和扎伊尔的埃博拉河地区，"埃博拉"由此得名。发病者有 发烧、呕吐、腹泻、体内外出血、脑肝肾功能损害等，死亡率高达50 %~90 %。埃博拉病毒感 染引起的疾病在2014年以前的称为"埃博拉出血热(Ebola hemorrhagic fever)" ；2014年 西非埃博拉疫情爆发之后，世界卫生组织和美国疾病预防控制中心已将埃博拉出血热更名 为埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)〇
[0003] 目前已发现的埃博拉病毒包括5个亚种：扎伊尔型（Zaire ebolavirus，EBOV)、苏 丹型（Sudan ebolavirus，SUDV)、塔伊森林型（iMForest ebolavirus，TAFV,又叫科特迪瓦 型或象牙海岸型）、本迪布焦型（Bundibugyoe ebolavirus ,BDBV)和莱斯顿型（Reston eb〇laviruS，RESTV)。前4种埃博拉病毒都有感染人类并导致类似临床症状的报道，目前仅 在非洲发现。其中，扎伊尔型对人致病性最强，苏丹型次之。
[0004] 在2014年西非埃博拉疫情肆虐之前，历史上埃博拉疫情共发生24起，死亡人数累 积约1500人，主要发生在非洲中部的刚果、乌干达、苏丹等地，疫情一般发生在人烟稀少的 地区，单次疫情死亡没有超过300人。2014年疫情起始于几内亚，迅速蔓延到了周边的利比 里亚、塞拉利昂等国家，众多EVD患者出现在人口稠密的大城市，如几内亚的首都科纳克里， 塞拉利昂的首都弗里敦，利比里亚首都蒙罗维亚和尼日利亚首都拉各斯，病毒呈现出沿交 通干线传播的特征，而且首次传播到非洲大陆以外的地区，如美国、英国、西班牙等地。截止 到2015年12月，死亡人数已逾万人。
[0005] 截止到2015年12月，目前世界上还没有批准的埃博拉疫苗或者治疗药物。许多实 验室和制药公司正在进行EB0V疫苗和治疗药物的研发。这些疫苗包括DNA疫苗、亚单位疫 苗、非复制型和可复制型病毒载体疫苗，一些DNA疫苗或者基于活病毒载体的疫苗已经进入 到临床研究阶段。
[0006] 埃博拉病毒包膜糖蛋白（GlyC〇pr〇tein，GP)是埃博拉病毒包膜唯一的表面蛋白， 具有2个阅读框，分别编码1个分泌型的小蛋白sGP和1个全长的跨膜GPAP被认为是埃博拉 病毒致病性的重要决定因素，它通过与受体结合介导病毒进入宿主细胞，并可通过与内皮 细胞结合破坏微血管的完整性，引起血管渗漏。而与此同时，GP也是诱导产生保护性免疫反 应的主要靶蛋白。目前，所有埃博拉病毒疫苗的研究基本上以GP(或GP联合NP)作为目标抗 原，而在动物实验中证明有效的单克隆抗体(或抗体混合物)也都是靶向于GP的抗体。传统 的灭活疫苗及亚单位疫苗对埃博拉病毒无效，目前在研的疫苗中动物保护效果良好的疫苗 是以GP为目标抗原的基于活病毒载体的疫苗。如何实现以最低的免疫剂量来携带尽可能多 的GP成为急需解决的问题。
[0007] AdMax系统由含有ΙοχΡ位点的穿梭质粒、骨架质粒和HEK-293细胞株组成，外源基 因序列被构建入穿梭质粒后，通过与骨架质粒在HEK-293细胞中进行基因重组来产生重组 腺病毒。
[0008] AdMax腺病毒系统是由Frank Graham在1999年创建的一套重组腺病毒构建系统， 目前已被加拿大的Micobix公司开发成为一种腺病毒载体包装系统。AdMax系统进行重组腺 病毒包装的基本原理是通过Cre-loxP或FLP-frt重组酶，使转染进HEK-293细胞的穿梭质粒 和骨架质粒发生定点重组，产生重组腺病毒，这样得到的重组病毒是E1缺失的复制缺陷型 腺病毒，病毒在不能够提供E1区的细胞中只能实现外源基因的表达而本身不具备增殖能 力。AdMax系统的特点是通过重组酶在真核细胞内完成重组出毒，高效且稳定，是目前最方 便快捷的腺病毒包装系统之一。
[0009] 与现在使用最普及的AdEasy系统相比，AdMax系统出毒更快，能够高效率、简便而 快速地获得重组腺病毒，并且病毒的产率(yielding)明显提高。利用AdMax系统，只需要2~ 4周就能完成从质粒构建到重组出毒的全过程，成功率大于98% (其中95%的克隆含有目的 基因），因为重组出毒是在真核细胞内完成的，保持了对腺病毒的生存压力，因此有助于保 持重组腺病毒基因组的完整性;而AdEasy系统的出毒成功率只有18-34% (Stratagene公司 新版的AdEasyXL系统成功率在94%左右），而且在原核细胞(BJ5183)中完成病毒基因组重 组，理论上，失去了生存压力的腺病毒基因组更容易发生突变，病毒遗传背景及活性可能会 受到影响。
[0010] 虽然AdMax系统具有出毒快，产率高等优点。但作为一种有效的活病毒载体疫苗， 除了载体本身的优势，如何使插入的外源目标蛋白更有效的表达至关重要。如果外源蛋白 的表达水平过低，需通过增加免疫剂量来获得有效的免疫效果，这样必然会增加载体对接 种者的不良影响。因此，通过对目标蛋白的基因进行优化，使其能够更高效的正确表达，是 提高疫苗免疫效果的一种有效方法。
[0011] 基于埃博拉病毒病的现实威胁，及现有技术在疫苗预防效果上效率不高，以及 AdMax系统在应用上存在的技术难题，本申请人欲通过对GP进行密码子优化，使其在真核细 胞中的表达量明显增高，并提供具有更强免疫原性，在相同剂量下能够诱导更高水平的抗 体的重组腺病毒载体埃博拉病毒病疫苗。
【发明内容】
[0012] 基于上述目的，本发明首先提供了一种用于重组腺病毒载体埃博拉疫苗的GP蛋白 基因密码子优化的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。所述核苷酸序列以 E1、E3联合缺失的复制缺陷型人5型腺病毒为载体，以整合腺病毒E1基因的HEK293细胞为包 装细胞系，经包装获得重组腺病毒载体埃博拉病毒病疫苗。
[0013] 本发明还提供了含有上述核苷酸序列的载体。
[0014] 在一个优选的实施方案中，所述载体为pDC316。
[0015] 本发明还提供了一种能够表达上述核苷酸序列的人复制缺陷重组腺病毒。
[0016] 在一个优选的实施方案中，所述重组腺病毒载体来源于AdMax腺病毒系统。
[0017] 本发明还提供了上述重组腺病毒载体在制备预防埃博拉病毒病疫苗中的应用。
[0018] 在一个优选的实施方案中，上述应用中，所述重组腺病毒被制备为注射剂。
[0019] 最后，本发明提供了一种制备上述的可表达埃博拉GP蛋白的重组腺病毒的方法， 所述方法包括以下步骤：
[0020] (1)构建含有埃博拉病毒GP蛋白核苷酸编码序列的穿梭质粒载体；
[0021 ] (2)将步骤(1)所述载体与骨架质粒一起转染入宿主细胞；
[0022] (3)培养步骤(2)所述宿主细胞；
[0023] (4)从步骤(3)所述宿主细胞中提取可表达埃博拉GP蛋白的人复制缺陷重组腺病 毒。
[0024]优选地，步骤(1)所述载体为pDC316。
[0025] 优选地，步骤(2)所述骨架质粒为pBHGl〇X_El，3Cre，两种质粒均属于AdMax腺病毒 系统，共同用于在宿主细胞中进行含有编码GP蛋白的核苷酸序列的重组腺病毒包装。
[0026] 优选地，步骤(3)所述细胞为HEK 293细胞
[0027] 优选地，在步骤(4)中采用Source 30Q和Sepharose4 FF两步法柱层析对重组埃博 拉病毒GP蛋白进行提取并纯化。
[0028] 本发明提供的可表达埃博拉GP蛋白的重组腺病毒作为埃博拉病毒病疫苗免疫动 物后，能在短时间内诱导机体产生强烈的细胞及体液免疫反应。该疫苗制备方法简单，可在 短期内大规模生产，用于应对突发埃博拉疫情和生物恐怖袭击。而且GP蛋白的基因经密码 子优化后，在转染细胞中的表达水平明显增高，以其为基础而包装的重组腺病毒载体埃博 拉病毒病疫苗所诱导的体液免疫水平在原有基础上又有很大程度的提高。体液免疫水平的 提高对于预防埃博拉病毒病的感染具有重要的意义。
【附图说明】
[0029]图1穿梭质粒图谱；
[0030] 图2 GP体外表达鉴定Western blot检测图谱；
[0031] 图3第一代毒种PCR鉴定图谱；
[0032]图4重组腺病毒埃博拉疫苗GP表达鉴定Western blot检测图谱；
[0033] 图5疫苗纯化Source 30Q层析图谱；
[0034] 图6疫苗纯化Sepharose 4 FF层析图谱；
[0035] 图7重组腺病毒埃博拉疫苗纯化样本PCR鉴定图谱；
[0036]图8重组腺病毒载体埃博拉疫苗纯化样品GP表达鉴定Western blot检测图谱；
[0037] 图9重组腺病毒载体埃博拉疫苗负染透射电镜观察图；
[0038] 图10重组腺病毒载体埃博拉疫苗冷冻切片透射电镜观察图；
[0039] 图11疫苗免疫小鼠血清抗体IgG水平随时间变化曲线图；
[0040] 图12流式细胞术检测疫苗免疫小鼠脾细胞IFN γ分泌水平的统计分析图；
[0041 ]图13 ELISP0T检测疫苗免疫小鼠脾细胞IFNy分泌水平统计分析图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
[0043]实施例1以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗的制备
[0044] 1 .GP基因密码子优化及合成。
[0045] 对2014年西非几内亚暴发流行的2&;[代型埃博拉病毒]\^1<:〇11&株(66116匕&111<:编号： KJ660346 · 1)包膜糖蛋白的基因使用Upgene软件（Gao，W.，Rzewski，A.，Sun，H.，R