一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcAls1及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属微生物基因工程技术领域，具体涉及植物保护领域中控制真菌致病性的 基因及其编码蛋白质的应用。
【背景技术】
[0002] 灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门（Ascomycota) 真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、 挂果期到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表 现为"V"形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和 蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20°C_23°C，相对湿度90%以上时发生严重。因 此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病 导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分 子研究技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。
[0003] 灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包 括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等， 这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然 条件下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、 分生孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染 来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的 分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子 萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要 从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。
[0004] 当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形 成的附着胞侵入;伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓 1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将 会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防 御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望 成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因 子(如毒素)来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子 机制仍所知甚少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子， 不仅有助于揭示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可 以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理 论和技术基础。
[0005] Alsl是一种氨基酮戊酸合成酶，参与催化血红素合成途径的第一步反应。该蛋白 广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等生物，由于血红素可以作为众多蛋白的辅基参与多种 生命过程，因此，作为催化血红素合成酶类之一的Alsl蛋白质具有重要的功能。Alsl蛋白质 在灰霉病菌中同样存在，而且功能尚未获得鉴定，通过分析灰霉病菌A1 s 1编码基因的致病 功能，评价该基因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛 选新型杀真菌药剂。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的旨在提供一种控制致病性的基因及其编码的蛋白质。
[0007] 本发明所提供的控制致病性基因来源于灰霉病菌，名称为BcAlsl，其DNA序列如 SEQ ID No:l所示。该DNA序列为BcAlsl基因开放阅读框，由1918个核苷酸组成，其中包含2 个外显子，分别位于SEQ ID No: 1的5'端第1位至337位核苷酸之间和第405位至1918位核苷 酸之间，组成的编码区长度合计为1851个核苷酸。
[0008] 本发明提供了BcAlsl基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，该 序列由616个氨基酸组成。
[0009] 来自灰霉病菌的控制致病性基因 BcAlsl可应用于植物抗灰霉病基因工程领域。
[0010] 对来自灰霉病菌的控制致病性基因 BcAlsl所编码的蛋白质进行缺失、突变或修 饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。
[0011]本发明证明了BcAlsl基因的缺失或突变，导致灰霉病菌致病力显著降低，说明 BcAlsl基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达 与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新 型杀菌剂，即本发明所提供的BcAlsl基因的一个重要用途是:该基因的表达与其编码的蛋 白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗真菌药剂(特别是抗灰 霉病菌药剂)的设计和筛选。
【附图说明】
[0012] 图1为BcAls 1蛋白质的结构域分析示意图
[0013] 其中：5-aminolevulinate synthase为氨基酮戊酸合成酶结构域；
[0014] 图2为灰霉病菌BcAlsl基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图 [0015] 其中：WT为野生型菌株B05.10，pAlsl-ko为敲除载体，BcAlsl-KO为BcAlsl基因缺 失突变体；
[0016]图3为BcAlsl基因缺失突变体及遗传互补菌株的PCR验证电泳图
[0017] 其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2;M1为BcAlsl基因缺失突变体;Ml/Alsl 为在突变体Ml基础上转入完整BcAlsl基因的互补菌株；
[0018] 图4为BcAlsl基因的突变体与野生型菌株的致病力比较照片
[0019] 其中：所选择寄主为番茄，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后进行评价； Ml、M2为两株独立获得的BcAlsl基因缺失突变体；
[0020] 图5为BcAlsl基因的突变体与对照菌株侵染寄主所产生病斑大小的定量分析示意 图
[0021] 其中：接种方法同上，接种3天后对叶片病斑面积进行测量计算，换算成相对大 小。**表示在ρ〈0·01水平上差异显著。
【具体实施方式】
[0022]为了更好地描述本发明，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例 中的方法，如无特别说明，均为常规方法。
[0023]实施例1 BcAlsl基因的相关性分析
[0024] 灰霉病菌BcAlsl基因的开放阅读框由1918个核苷酸组成，包含2个外显子，编码区 cDNA全长为1851个核苷酸，编码的蛋白质产物由616个氨基酸组成。取BcAlsl蛋白质序列进 行比对分析(http://blast .ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现A1 si广泛存在于动物、植 物、真菌和细菌等细胞生物中。结构域分析发现，BcAlsl蛋白质包含一个保守的氨基酮戊酸 合成酶结构域(见图1)。
[0025] 实施例2 BcAlsl基因的敲除
[0026] 1)敲除载体的构建
[0027] 采用引物A1 s 1-UP-F (5 ' -GAATTCATGGTGCTCGTATCGTTTGA-3 '）与A1 s 1-UP-R (5 ' -GGTACCGCGGGATGATGGATTATTATGT-3 '），以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增 BcAls 1 基因上游603bp片段，采用A1 s 1-DN-F(5 ' -GGATCCTCCTCGGACCCAATACCA