一种辐照灭菌前对生物材料进行保护的方法
【专利摘要】本发明公开了一种辐照灭菌前对生物材料进行保护的方法。本发明提供的辐照灭菌前对生物材料进行保护的方法，为用0.01-0.5g/100ml的辐照保护剂溶液0-25℃浸泡处理所述生物材料1-24小时；所述辐照保护剂溶液为天然黄酮溶液或类黄酮溶液。本发明中选取类黄酮类试剂作为稳定有效的辐照保护剂对产品进行辐照保护，最大化降低了辐照过程对产品固有蛋白结构的破坏，保护作用效果明显且性质稳定，残留易控制，低毒，不会破坏产品或污染环境。
【专利说明】一种辐照灭菌前对生物材料进行保护的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种辐照灭菌前对生物材料进行保护的方法。
【背景技术】
[0002]现代外科手术中，常使用天然胶原支架材料对一些缺损的组织和器官进行修补。天然的胶原支架材料其主要成分是胶原蛋白，在使用前需要进行灭菌。常规的灭菌方式为物理灭菌和化学灭菌。
[0003]物理灭菌分湿热灭菌和干热灭菌两种，均需要对胶原支架材料进行高温处理，在高温处理的过程中会引起胶原蛋白的失活。
[0004]化学灭菌通常选择具有灭菌效果的试剂或者气体对胶原支架材料进行灭菌。常见的试剂有环氧乙烷、乳酸等，这类试剂本身具有生物毒性，使用其进行其灭菌很难控制其在胶原支架材料中的残余量。
[0005]基于物理灭菌和化学灭菌的局限性，人们开始尝试使用辐照灭菌。辐照灭菌既可以避免化学灭菌中的毒性残留问题，又避免了高温对胶原蛋白的伤害，同时还具有操作方便，灭菌效果理想的优点。但辐照灭菌任然对胶原蛋白有一定的破坏作用。
[0006]辐照灭菌的优势在于没有试剂添加，无毒无污染，操作简便，灭菌效果理想，但是常规的辐照灭菌方式对蛋白类产品依然有破坏作用，会导致蛋白变性。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是提供一种辐照灭菌前对生物材料进行保护的方法。
[0008]本发明提供的辐照灭菌前对生物材料进行保护的方法，为用0.01-0.5g/100ml的辐照保护剂溶液0-25°C浸泡处理所述生物材料1-24小时；所述辐照保护剂溶液为天然黄酮溶液或类黄酮溶液。
[0009]所述辐照保护剂为黄芩素或黄芩苷时，所述浸泡处理的条件为:使用0.005-0.02g/100ml (如 0.005-0.01g/100mU0.01-0.02g/100ml、0.005g/100ml、0.01g/100ml 或 0.02g/100ml)的辐照保护剂溶液 0-12°C(如 0_8°C、4_12°C、2±2°C、6±2°C或10±2°C)浸泡处理4-8小时(如4-6小时、6-8小时、4小时、6小时或8小时)。所述辐照保护剂为黄芩素时，所述辐照保护剂溶液的制备方法为:取0.005-0.02g (如0.005-0.0lg,0.01-0.02g、0.005g、0.0lg 或 0.02g)黄芩素，用水定容至 100ml，然后加入 0.04-0.1gNaOH,搅拌至黄芩素溶解。所述辐照保护剂为黄芩苷时，所述辐照保护剂溶液的制备方法为:取 0.005-0.02g (如 0.005-0.0lg,0.01-0.02g、0.005g、0.0lg 或 0.02g)黄芩苷，用水定容至100ml，然后加入0.04-0.1gNaOH，搅拌至黄芩苷溶解。
[0010]所述辐照保护剂为芹菜素时，所述浸泡处理的条件为:使用0.1-0.5g/100ml (如0.1-0.3g/100ml、0.3-0.5g/100ml、0.lg/100ml、0.3g/100ml 或 0.5g/100ml)的辐照保护剂溶液 8-20°C (如 8-16°C、12-20°C、10±2°C、14±2°C或 18±2°C)浸泡处理 16-24 小时(如16-20小时、20-24小时、16小时、20小时或24小时)。所述辐照保护剂为芹菜素时，所述辐照保护剂溶液的制备方法为:取0.1-0.5g (如0.1-0.3g、0.3-0.5g、0.lg、0.3g或0.5g)芹菜素，用水定容至100ml,然后加入0.004-0.04gNa0H,搅拌至疗菜素溶解。
[0011]所述辐照保护剂为山柰酚时，所述浸泡处理的条件为:使用0.05-0.5g/100ml (如0.05-0.3g/100ml、0.3-0.5g/100ml、0.05g/100ml、0.3g/100ml 或 0.5g/100ml)的辐照保护剂溶液 15-25°C (如 15-22°C、18-25°C、17±2°C、20±2°C 或 23±2°C)浸泡处理 1-2 小时(如I小时或2小时)。所述辐照保护剂为山柰酚时，所述辐照保护剂溶液的制备方法为:取0.05-0.5g (如 0.05-0.3g、0.3-0.5g、0.05g、0.3g 或 0.5g)山柰酚，用水定容至 100ml，然后加入0.04-0.1g NaOH，搅拌至山柰酚溶解。
[0012]所述辐照保护剂为杨梅素时，所述浸泡处理的条件为:使用0.01-0.02g/100ml(如0.01g/100ml或0.02g/100ml)的辐照保护剂溶液0_8°C (如2±2°C或6±2°C )浸泡处理16-24小时(如16小时或24小时)。所述辐照保护剂为杨梅素时，所述辐照保护剂溶液的溶剂为水。
[0013]所述辐照保护剂为槲皮素时，所述浸泡处理的条件为:使用0.01-0.5g/100ml (如0.01-0.3g/100ml、0.3-0.5g/100ml、0.01g/100ml、0.3g/100ml 或 0.5g/100ml)的辐照保护剂溶液 0-25 °C (如 0-14°C、10-25 °C、2 ± 2 °C、12 ± 2 °C 或 23 ± 2 °C )浸泡处理 4-8 小时(如 4-6小时、6-8小时、4小时、6小时或8小时)。所述辐照保护剂为槲皮素时，所述辐照保护剂溶液的制备方法为-M 0.01-0.5g (如 0.01-0.3g、0.3-0.5g、0.01g、0.3g 或 0.5g)槲皮素，用水定容至100ml,然后加入0.04-0.1g NaOH,搅拌至槲皮素溶解。
[0014]所述辐照保护剂为甘草素时，所述浸泡处理的条件为:使用0.1-0.5g/100ml (如0.lg/100ml或0.5g/100ml)的辐照保护剂溶液15-25°C (如17±2°C或23±2°C )浸泡处理1-2小时(如I小时或2小时)。所述辐照保护剂为甘草素时，所述辐照保护剂溶液的制备方法为:取0.1-0.5g (如0.lg、或0.5g)甘草素，用水定容至100ml，然后加入0.04-0.1gNaOH,搅拌至甘草素溶解。
[0015]以上任一所述方法在制备手术用生物材料中的应用也属于本发明的保护范围。
[0016]本发明还保护一种制备手术用生物材料的方法，包括如下步骤:
[0017](I)使用碱溶液浸泡处理富含胶原蛋白的离体生物组织；
[0018](2)使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤(I)的产物；
[0019](3)使用碱溶液浸泡处理步骤(2)的产物；
[0020](4)将步骤(3)的产物按照权利要求1至7中任一所述的方法进行操作；
[0021](5)使用PBS缓冲液浸泡处理步骤(4)的产物；
[0022](6)将步骤(5)的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到手术用生物材料。
[0023]所述步骤(I)中:所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH或Κ0Η。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.5-2M (如0.5-1Μ、1-2Μ、0.5M、IM或2M)。所述步骤(I)中:所述浸泡处理的条件可为:0-25°C (如0_8°C、4_25°C、2±2°C、6±2°C或23±2°C)、1_3小时(如I小时或3小时)。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。
[0024]所述步骤(2)中:所述表面活性剂可为非离子型表面活性剂，要求残留可控、无细胞毒性或低细胞毒性、不会污染环境。所述步骤(2)中:所述表面活性剂可为TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5_3g/100ml (如0.l-2g/100ml、2g-5g/100ml、0.lg/100ml、2g/100ml 或 5g/100ml)。所述步骤(2)中:所述浸泡处理的条件可为:0-25°C (如 0-18°C、14-25°C、2±2°C、16±2°C或 23±2°C )、8_168 小时(如8-10小时、10-168小时、8小时、10小时或168小时)。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。
[0025]所述步骤(3)中:所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH或Κ0Η。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.5-3M(如0.5-1Μ、0.5_1M、1_3M、0.5M、1M或2M)。所述步骤(3)中:所述浸泡处理的条件可为:0_25°C (如0_10°C、6_25°C、2 ± 2 °C、15 ± 2 °C 或 23 ± 2 °C )、10-60 分钟(如 10-15 分钟、15-60 分钟、10 分钟、15 分钟或 60分钟)。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。
[0026]所述步骤(5)中:所述PBS 缓冲液的 pH 可为 5.8-7.8 (如 5.8_7.2、7.2_7.8、5.8、
7.2或7.8)。所述步骤(5)中:所述浸泡处理的条件可为:0-25°C (如0_10°C、6_25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、4-168 小时(如 4-10 小时、10-168 小时、4 小时、10 小时或 168小时)。
[0027]所述灭菌为钴-60辐射灭菌。所述钴-60辐射灭菌的辐照剂量具体可为10-30KGy(如 10-25KGy、25-30KGy、1KGy、25KGy 或 30KGy)。
[0028]所述富含胶原蛋白的生物组织可为膜胶原、骨胶原、筋膜、防粘连膜等，如食管。
[0029]所述动物具体可为猪或牛。
[0030]本发明还保护一种制备手术用生物材料的方法，包括如下步骤:
[0031 ] (I)使用碱溶液浸泡处理离体的动物骨组织；
[0032](2)使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤(I)的产物；
[0033](3)使用碱溶液浸泡处理步骤(2)的产物；
[0034](4)将步骤(3)的产物按照权利要求1至7中任一所述的方法进行操作；
[0035](5)使用PBS缓冲液浸泡处理步骤(4)的产物；
[0036](6)将步骤(5)的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到手术用生物材料。
[0037]所述步骤(I)中:所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH或Κ0Η。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.5-2M (如0.5-1Μ、1-2Μ、0.5M、IM或2M)。所述步骤(I)中:所述浸泡处理的条件可为:0-25°C (如0_8°C、4_25°C、2±2°C、6±2°C或23±2°C)、1_3小时(如I小时或3小时)。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。
[0038]所述步骤(2)中:所述表面活性剂可为非离子型表面活性剂，要求残留可控、无细胞毒性或低细胞毒性、不会污染环境。所述步骤(2)中:所述表面活性剂可为TritonX-100、Tween-80或Tween-40。所述表面活性剂溶液中，表面活性剂的浓度可为0.5_3g/100ml (如0.l-2g/100ml、2g-5g/100ml、0.lg/100ml、2g/100ml 或 5g/100ml)。所述步骤(2)中:所述浸泡处理的条件可为:0-25°C (如 0-18°C、14-25°C、2±2°C、16±2°C或 23±2°C )、8_168 小时(如8-10小时、10-168小时、8小时、10小时或168小时)。所述表面活性剂溶液具体可为表面活性剂水溶液。
[0039]所述步骤(3)中:所述碱溶液可为碱性化合物溶液。所述碱性化合物可为NaOH或Κ0Η。所述碱性化合物溶液中，所述碱性化合物的浓度可为0.5-3M(如0.5-1Μ、0.5_1M、1_3M、
0.5M、1M或2M)。所述步骤(3)中:所述浸泡处理的条件可为:0_25°C (如0_10°C、6_25°C、2 ± 2 °C、15 ± 2 °C 或 23 ± 2 °C )、10-60 分钟(如 10-15 分钟、15-60 分钟、10 分钟、15 分钟或 60
分钟)。所述碱溶液具体可为碱性化合物的水溶液。
[0040]所述步骤(5)中:所述PBS 缓冲液的 pH 可为 5.8-7.8 (如 5.8_7.2、7.2_7.8、5.8、
7.2或7.8)。所述步骤(5)中:所述浸泡处理的条件可为:0-25°C (如0_10°C、6_25°C、2±2°C、8±2°C或 23±2°C)、4-168 小时(如 4-10 小时、10-168 小时、4 小时、10 小时或 168小时)。
[0041]所述灭菌为钴-60辐射灭菌。所述钴-60辐射灭菌的辐照剂量具体可为10-30KGy(如 10-25KGy、25-30KGy、1KGy、25KGy 或 30KGy)。
[0042]所述骨组织可为动物腿骨的骨松质、动物长骨的骨松质、动物肋软骨、动物关节软骨或动物四肢骨的骨干等。
[0043]所述动物具体可为牛或猪。
[0044]以往生产天然胶原支架材料的工艺，没有辐照保护的步骤。产品在冻干辐照后，天然的胶原蛋白会被大幅破坏。最终导致产品撕裂力下降和降解速度加快。而选择辐照保护剂的工艺也存在以下问题:一，保护剂的毒性问题，若选取的辐照保护剂存在毒性，则要控制保护剂的使用量以及其最终在产品上的残留量；二，保护剂的稳定性问题，大多数辐照保护剂均具有较强的还原性，这种还原性导致试剂本身不稳定，从而在辐照过程中也不能对产品进行有效且稳定的保护。本发明中选取类黄酮类试剂(一种天然提取物，低毒性，无刺激性异味，残留可控，安全有效，其本身不会对产品本身产生破坏)作为稳定有效的辐照保护剂对产品进行辐照保护，最大化降低了辐照过程对产品固有蛋白结构的破坏，保护作用效果明显且性质稳定，残留易控制，低毒，不会破坏产品或污染环境。
【具体实施方式】
[0045]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0046]黄芩素:国药集团化学试剂有限公司，产品编号为XW080047，CAS编号为491-67-8。
[0047]黄芩苷:国药集团化学试剂有限公司，产品编号为XW080046，CAS编号为21967-41-9。
[0048]芹菜素:国药集团化学试剂有限公司，产品编号为XW080007，CAS编号为520-36-5。
[0049]山柰酚:(上海纯优生物科技有限公司，产品编号P0013，CAS编号520_18_3)。
[0050]杨梅素:(上海纯优生物科技有限公司，产品编号P0287，CAS编号529_44_2)。
[0051]槲皮素:国药集团化学试剂有限公司，产品编号为69022033，CAS编号为117-39-5。
[0052]甘草素:(上海纯优生物科技有限公司，产品编号P0296，CAS编号578_86_9)。
[0053]黄岑素的结构式如下:
[0054]
【权利要求】
1.一种辐照灭菌前对生物材料进行保护的方法，为用0.01-0.5g/100ml的辐照保护剂溶液0-25°C浸泡处理所述生物材料1-24小时；所述辐照保护剂溶液为天然黄酮溶液或类黄酮溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述辐照保护剂为黄芩素或黄芩苷；所述浸泡处理的条件为:使用0.005-0.02g/100ml的辐照保护剂溶液0_12°C浸泡处理4_8小时。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述辐照保护剂为芹菜素；所述浸泡处理的条件为:使用0.1-0.5g/100ml的辐照保护剂溶液8_20°C浸泡处理16-24小时。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述辐照保护剂为山柰酚；所述浸泡处理的条件为:使用0.05-0.5g/100ml的辐照保护剂溶液15_25°C浸泡处理1_2小时。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述辐照保护剂为杨梅素；所述浸泡处理的条件为:使用0.01-0.02g/100ml的辐照保护剂溶液0_8°C浸泡处理16-24小时。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述辐照保护剂为槲皮素；所述浸泡处理的条件为:使用0.01-0.5g/100ml的辐照保护剂溶液0_25°C浸泡处理4_8小时。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述辐照保护剂为甘草素；所述浸泡处理的条件为:使用0.1-0.5g/100ml的辐照保护剂溶液15_25°C浸泡处理1_2小时。
8.权利要求1至7中任一所述方法在制备手术用生物材料中的应用。
9.一种制备手术用生物材料的方法，包括如下步骤: (O使用碱溶液浸泡处理富含胶原蛋白的离体生物组织； (2)使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤(I)的产物； (3)使用碱溶液浸泡处理步骤(2)的产物； (4)将步骤(3)的产物按照权利要求1至7中任一所述的方法进行操作； (5)使用PBS缓冲液浸泡处理步骤(4)的产物； (6)将步骤(5)的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到手术用生物材料。
10.一种制备手术用生物材料的方法，包括如下步骤: (O使用碱溶液浸泡处理离体的动物骨组织； (2)使用表面活性剂溶液浸泡处理步骤(I)的产物； (3)使用碱溶液浸泡处理步骤(2)的产物； (4)将步骤(3)的产物按照权利要求1至7中任一所述的方法进行操作； (5)使用PBS缓冲液浸泡处理步骤(4)的产物； (6)将步骤(5)的产物依次进行冷冻干燥和辐照灭菌，得到手术用生物材料。
【文档编号】A01N1/02GK104170815SQ201310192548
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2013年5月22日
【发明者】郭松, 董佳桓, 孙先昌, 辛春凤, 于学珍 申请人:烟台正海生物技术有限公司