一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法
【专利摘要】本发明涉及植物快繁方法技术，公开了一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括下列步骤：取大叶蚁塔无菌外植体，在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养、生根培养，获得生根试管苗，进行栽种。本发明将大叶蚁塔的年繁殖系数由自然状态下的1:1，提高到1:1000000，成本由原来的每株80~100元，降低至每株1~2元，生产周期短，繁殖系数高、生产步骤衔接紧密、成本低廉，生产得到的大叶蚁塔种苗品质高，一致性好，并且从幼苗开始驯化，能逐步适应上海甚至长三角地区的土壤气候条件，具有广阔的市场前景。
【专利说明】一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物快繁方法技术，尤其涉及了一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法。
【背景技术】
[0002]大叶蚁塔(era man I ca ta L.),小二仙草科根乃拉草属多年生草本,植株的高度可达2?3米，原产南美洲巴西亚马逊河流域一带。超大型观叶植物，整片叶子就像一把带刺的雨伞，直径可达4米，最大的叶片能把3个并排骑马的人，连人带马遮盖住，寻常叶片能盖住一个成人。是世界上目前发现的草本植物中叶片硕大的植物之一，已被收录入吉尼斯世界纪录。种子却极其细小，种皮也极其坚硬，不透水，不透气，休眠期长，萌发率极低。
[0003]目前国内大叶蚁塔数量不多，未见结籽，分株、切根等繁殖速度极慢，周期长，不利于优良种苗的推广。其次因其原产于亚马逊河流域热带雨林，喜欢温暖湿润气候，上海曾经几次引种大型种苗，却都难以成活。因此我们采用了离体培养的方式，建立快速繁殖技术，除繁育优质种苗降低昂贵的引种费之外，并通过控制光照、温度、湿度，从幼苗期开始驯化，使之能逐步适应上海甚至长三角的土壤条件和气候条件，让市民早日欣赏到这一奇特植物。该植物在生物学观察、栽培种植、快速繁育方面，目前未见任何报道。
【发明内容】
[0004]本发明针对现有技术中大叶蚁塔在国内温带地区繁殖速度极慢，生长周期长，繁育优质种苗费用昂贵等缺点，提供了一种采用离体培养的方式，建立快速繁殖技术，通过控制光照、温度、湿度，从幼苗期开始驯化，使之能逐步适应上海甚至长三角的土壤条件和气候条件，具有周期短，繁殖系数高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法。
[0005]本发明中，所用到的培养基及激素包括:MS培养基(Murashing and Skoogmedium,以下简称MS), MS配方中的药品成分和培养基的具体配制方法为现有公知技术，在此不再赘述。附加的植物激素为6-节基氨基嘌呤(benzylaminopurine,简称为6-BA)、奈乙酸(naphthylene acetic acid,简称为 NAA)、玉米素(Zeatin,以下简称为 ZT)。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决:
一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括下列步骤:取大叶蚁塔无菌外植体，在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养、生根培养，获得生根试管苗，进行栽种。
[0007]作为优选，所述的初代培养为:选择并清洗、消毒处理大叶蚁塔茎尖获得起始的无菌外植体，接种到初代培养基上，进行初代培养，获得无菌苗；
增殖培养:是将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，诱导丛生芽；
叶盘法诱导不定芽培养:取诱导出丛生芽的无菌苗的幼嫩叶片，转移至不定芽诱导培养基培养，诱导出不定芽； 生根培养:将叶盘法诱导分化的不定芽，从叶盘上切下，取高度为0.5cm左右，转移至生根培养基中，获得生根试管苗；
最后，对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。
[0008]叶盘法诱导不定芽培养即叶盘法诱导不定芽分化培养；叶盘法诱导不定芽培养基即叶盘法诱导不定芽分化培养基。
[0009]作为优选，所述的大叶蚁塔无菌外植体的获得方法为:取大叶蚁塔肥厚的茎尖，切取成为长度0.5?lcm，直径为0.3^0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部，保护生长点，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理；消毒处理方法是:先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3?4次，然后用加有2?4滴吐温-80 (油酸酯)的0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分钟，无菌水冲洗至无残留，得到无菌外植体。
[0010]作为优选，所述的增殖培养基为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-ΒΑ)0.Γ2.SmgL—1+奈乙酸(NAA) 0.Γ0.Smgr1+蔗糖25158171+琼脂CSgL'诱导出丛生芽。增殖培养基优选为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) Imgr1+奈乙酸(NAA) 0.1mgL^1+蔗糖3(^171+琼脂6 gL—1，丛生芽增殖率为1:3?5。
[0011]作为优选，所述的叶盘法诱导不定芽培养基为::MS+玉米素(ZT) 0.15^2.SmgL^1+奈乙酸(NAA) 0.1、.Smgr1+蔗糖25?35 gL—1+琼脂4?8 gL'叶盘法诱导不定芽培养基优选为:MS+玉米素(ZT)LOmgL-1 +奈乙酸(NAA)0.lmgL—1+蔗糖30 gL—1+琼脂6 gL—1，叶盘分化率为95%，每片叶盘上可以再生出1(Γ15株整齐细小的不定芽。
[0012]作为优选，所述的生根培养基为1/2MS+奈乙酸(NAA) 0.Γ2.SmgL—1+蔗糖15?258171+琼脂4?SgL'生根培养基优选为:1/2MS+奈乙酸(NAA) 1.0mgL—1+蔗糖2(^171+琼脂egL—1，生根率最高达到95%，诱导生成的根数量众多，长势旺盛。
[0013]作为优选，所述的初代培养基为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.15^0.25mgr1+奈乙酸(NAA) 0.15?0.25mgr1+蔗糖25?3581^+琼脂4?SgL'优选为MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg^1+ 奈乙酸(NAA) 0.lSmgL—1+ 蔗糖 SlgL^1+ 琼脂 egL-1。
[0014]作为优选，所述的初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为l(Tl5h/d，光照强度150(Γ25001χ，培养温度为室温，初代培养的周期为22?28天，增殖培养的周期为28?32天，叶盘法诱导不定芽发生培养的周期为18?22天，生根培养的周期为28?32天。
[0015]作为优选，所述的生根培养步骤中:将生根试管苗置于自然环境中6?10天，取出洗净根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始30天内保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，待新的根系发育完整后，再逐渐降低湿度，加强光强至全光照，成活率可以达到90%。
[0016]作为优选，所述的生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土:珍珠岩:腐殖质=1:1:1。
[0017]本发明的目的在于设计一种大叶蚁塔快繁技术，寻找适用于大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的技术方案，生产的大叶蚁塔种苗品质高，一致性好，从幼苗期开始驯化，使之能逐步适应上海甚至长三角的土壤条件和气候条件，让市民早日欣赏到这一奇特植物。
[0018]本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果:本发明将大叶蚁塔的年繁殖系数由自然状态下的1:1，提高到1:1000000，成本由原来的每株8(Γ100元，降低至每株广2元，提供了一种周期短，繁殖系数高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的大叶蚁塔组培育苗方法。生产得到的大叶蚁塔种苗品质高，一致性好，并且从幼苗开始驯化，能逐步适应上海甚至长三角地区的土壤气候条件，具有广阔的市场前景。
【具体实施方式】
[0019]下面结合实施例对本发明作进一步详细描述:
实施例1
一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括下列步骤:取大叶蚁塔无菌外植体，在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养、生根培养，获得生根试管苗，进行栽种。
[0020]初代培养为:选择并清洗、消毒处理茎尖获得起始的无菌外植体，接种到初代培养基上，进行初代培养，获得无菌苗，其中初代培养基为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-ΒΑ)0.15?0.25mgL-1+ 奈乙酸(NAA) 0.15?0.25mgL-1+ 蔗糖 25?35gL-1+ 琼脂 4?8gL-1 ；
增殖培养:是将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，诱导丛生芽，该增殖培养基为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.Γ2.SmgL^1+ 奈乙酸(NAA) 0.Γθ.SmgL^1+ 蔗糖 25?358171+ 琼脂fSgL—1，诱导出丛生芽；
叶盘法诱导不定芽培养:取无菌苗的幼嫩叶片，转移至不定芽诱导培养基培养，该培养基为=MS+ 玉米素(ZT) 0.15?2.SmgL-1+ 奈乙酸(NAA) 0.1?0.SmgL^1+ 蔗糖 25?35 g^1+ 琼脂4?8 gL-1 ；
生根培养:将叶盘法诱导分化的不定芽，从叶盘上切下，取高度为0.5cm左右，转移至生根培养基中，获得生根试管苗，该生根培养基为1/2MS+奈乙酸(NAA) 0.Γ2.SmgL—1+蔗糖15?258171+ 琼脂 4?SgL—1 ；
最后，对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。
[0021]大叶蚁塔无菌外植体的获得方法为:取大叶蚁塔肥厚的茎尖，切取成为长度0.5?lcm，直径为0.3^0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部，保护生长点，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理；消毒处理方法是:先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3?4次，然后用加有2?4滴吐温-80(油酸酯)的0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分钟，无菌水冲洗至无残留，得到无菌外植体。
[0022]增殖培养基为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) lmgL—1+奈乙酸(NAA) 0.lmgL—1+蔗糖SOgr1+琼脂6 gL_S丛生芽增殖率为1:3?5。
[0023]叶盘法诱导不定芽培养基为:MS+玉米素(ZT) 1.0mgr1 +奈乙酸(NAA) 0.1mgL^1+蔗糖30 gL—1+琼脂6 gL—1，叶盘分化率为95%，每片叶盘上可以再生出1(Γ15株整齐细小的不定芽。
[0024]生根培养基为:1/2MS+奈乙酸(NAA) 1.0mgL—1+蔗糖2(^171+琼脂68?Λ生根率最高达到95%，诱导生成的根数量众多，长势旺盛。
[0025]初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽发生和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为l(Tl5h/d，光照强度150(Γ25001χ，培养温度为室温。初代培养的周期为22?28天，增殖培养的周期为28?32天，叶盘法诱导不定芽发生培养的周期为If 22天，生根培养的周期为28?32天。
[0026]生根培养步骤中:将生根试管苗置于自然环境中6?10天，取出洗净根部，用500^600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始30天内保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，待新的根系发育完整后，再逐渐降低湿度，加强光强至全光照，成活率可以达到90%。生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土:珍珠岩:腐殖质=1:1:1。
[0027]采用本发明所提供的方法，对加快大叶蚁塔的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗进行增殖培养，并取其叶片诱导个体较小的不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。
[0028]实施例2
一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括下述步骤:
a、选择生长健壮，无病虫害大叶蚁塔茎尖做为起始外植体，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理。
[0029]b、将消毒处理后的茎尖接种到初代培养基上，进行初代培养；
C、将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，该增殖培养基为MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.Γ2.Smgr1+奈乙酸(NAA) 0.Γθ.SmgL^1+蔗糖25?358171+琼脂fSgL'诱导无菌苗的增殖；
d、取无菌苗的幼嫩叶片，转移至不定芽诱导培养基培养，该培养基为MS+玉米素(ZT)0.15?2.5mgL-1+ 奈乙酸(NAA) 0.1?0.5mgL-1+ 蔗糖 25?35 gL-1+ 琼脂 4?8 gL_1
e、将叶盘上分化出的高度为0.5cm的试管苗分切后，转移至生根培养基，该生根培养基为 1/2MS+ 奈乙酸(NAA) 0.Γ2.SmgL—1+ 蔗糖 15?258171+ 琼脂 4?SgL'
[0030]f、对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。
[0031]步骤a中，取大叶蚁塔茎尖，切取成为长度0.5?lcm，直径为0.3^0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，进行消毒处理。步骤a中，先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3?4次，然后用加有2?4滴吐温80的0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分钟，用无菌水冲洗至无残留，得到无菌的外植体。
[0032]在上述方案的基础上，步骤a中，所述的外植体长度为0.5?lcm，可以为0.5,0.6、0.7,0.8,0.9、lcm，直径为0.3?0.6cm，可以为0.3,0.4,0.5,0.6的圆柱体。在上述方案的基础上，步骤a中，所述的清洗消毒处理的方法包括:取大叶蚁塔茎尖，用水冲洗干净，去除叶片，切成圆柱体，并使生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3?4次，然后用加有2?4滴吐温80的0.Γθ.2%的升汞液浸泡15?30分钟，用无菌水冲洗至无残留无异味，得到无菌的外植体。具体的，72%浓度酒精消毒时间可以为30s、40s、50s、60s，升汞液浓度可以为0.1%、0.15%、0.2%，，浸泡时间可以为15、18、20、25、28、30分钟。
[0033]步骤b中，将步骤a中所得到的无菌外植体接种到初代培养基MS+6-BA0.15?0.25mgL-1+ 奈乙酸(NAA) 0.15?0.25mgL-1+ 蔗糖 25?35gL-1+ 琼脂 4?8 gL'
[0034]在上述方案的基础上，步骤b中，所述初代培养基为MS+6-BA0.15^0.2511^171+奈乙酸(NAA) 0.15^0.25mgr1+蔗糖25158171+琼脂r8gL'具体的，在初代培养基中，6-BA的激素浓度可以为0.15,0.18,0.2,0.22,0.25 mgL—1，奈乙酸(NAA)的激素浓度可以为0.15、0.18、0.2、0.22、0.25 mgl/1，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35 gl/1，琼脂的浓度可以为4、
5、6、7、8 gL'在初代培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，培养周期为22?28天，优选25天。
[0035]步骤c中，所述的最佳增殖培养基为MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) lmgL—1+奈乙酸(NAA) 0.1 mgr1+蔗糖SOgL—1+琼脂6 gL—1，丛芽增殖率为1:3?5。
[0036]在上述方案的基础上，步骤c中，所述增殖培养基为MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.Γ2.Smgr1+ 奈乙酸(NAA) 0.1?0.SmgL—1+ 蔗糖 25^358^+ 琼脂 4?SgL' 具体的，6-苄氨基嘌呤(6-BA)的激素浓度可以为0.1,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5、mgL—1，奈乙酸(NAA)的激素浓度可以为0.1、0.2、0.4、0.SmgL—1，蔗糖的浓度可以为25，28，30，32、35 gL—1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8 gL'所述的增殖培养基最佳的激素组合及浓度为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) Imgr1+奈乙酸(NAA) 0.1mgL^1+蔗糖3(^171+琼脂egL—1 ;在增殖培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，培养周期为28?32天，优选30天，由此大叶蚁塔试管苗的月增殖系数为1:3?5。
[0037]步骤d中，所述的叶盘法诱导不定芽最佳培养基为MS+玉米素(ZT) 1.0mgL-1 +奈乙酸(NAA) 0.1mgr1+蔗糖3(^171+琼脂6 gL—1，叶盘分化率为95%，每片叶盘上可以再生出1(Γ15株整齐细小的不定芽。
[0038]在上述方案的基础上，步骤d中，所述的叶盘法诱导不定芽发生培养基为MS+玉米素(ZT) 0.15?2.SmgL—1+奈乙酸(NAA) 0.1?0.SmgL—1+蔗糖 25?35 gl/1+琼脂 4?8 gL' 具体的，在叶盘法诱导不定芽发生的培养基中，玉米素(ZT)的激素浓度可以为0.15,0.25、
0.3,0.5,0.8,1.0,1.5,2.0,2.5 mgl/1，奈乙酸(NAA)的激素浓度可以为 0.1,0.2,0.3,0.4、
0.SmgL—1，蔗糖的浓度可以为25、28、30、32、35 gL—1，琼脂的浓度可以为4、5、6、7、8 gL-1。优选的叶盘不定芽分化培养基为:MS+玉米素(ZT) !.(^!^+奈乙酸⑶八八)。.lmgL—1+蔗糖SOgr1+琼脂egL—1 ;在叶盘诱导不定芽培养过程中，培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，培养周期为18?22天，优选20天，由此叶盘分化率为95%，每片叶盘上可以再生出1(Γ?5株整齐细小的不定芽。
[0039]步骤e中，所述的最佳生根培养基为1/2MS+奈乙酸(NAA) 1.0mgL^1+蔗糖2(^171+琼脂egL—1，生根率最高达到95%，诱导生成的根数量众多，长势旺盛。
[0040]在上述方案的基础上，步骤e中，所述生根培养基为1/2MS+奈乙酸(NAA)
0.Γ2.Smgr1+蔗糖15?258171+琼脂rSgL'具体奈乙酸(NAA)的激素浓度可以为0.1,0.2、
0.5,1.0,1.5,2.0,2.SmgL-1，，蔗糖的浓度可以为15、18、20、22、25 gl/1，琼脂的浓度可以为
4、5、6、7、8 gL'所述的生根培养基最佳的激素和矿质元素及碳源组合浓度值为:1/2MS+奈乙酸(NAA)l.0mgr1+蔗糖2(^171+琼脂6 gL—1 ;培养条件为无菌室内光周期为l(Tl5h/d，优选12h/d，光照强度150(Γ25001χ，优选20001χ，培养温度为室温，优选25°C，生根培养的周期为28?32天，优选30天。由此生根率最高可达95%，根数量众多。
[0041]步骤b至e中，初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为l(Tl5h/d，光照强度150(Γ25001χ，培养温度为室温。步骤b至e中，初代培养的周期为22?28天，增殖培养的周期为28?32天，叶盘不定芽诱导培养的周期为18?22天，生根培养的周期为28?32天。
[0042]步骤f中，将生根试管苗置于自然环境中6?10天，取出洗净根部，用500飞00倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始30天内保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%，并适当遮阳，待萌发新的根系后，逐渐加强光照至全光照，进行栽种。步骤f中，生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土:珍珠岩:腐殖质=1:1:1。
[0043]在上述方案的基础上，步骤f中，将生根试管苗至于自然环境中6?10天，一般为一周，取出洗净，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，一般草炭土:珍珠岩:腐殖质=1:1:1，起始30天内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，待其萌发新根后，逐渐加强光照至全光照。
[0044]实施例3
一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，包括大叶蚁塔无菌外植体经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养和生根培养获得再生植株，进行移栽，包括下述步骤:
第一步:大叶蚁塔茎尖肥大，长期深埋于土壤中，感染各种外源微生物机会多，因此消毒获得完全无菌的材料非常困难。经过反复实验，本发明得到以下最佳外植体处理方式:于天气晴朗的中午,选择生长健壮,无病虫害大叶蚁塔茎尖做为外植体,切取成为长度
0.5^1cm,直径为0.3^0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部保护生长点，以减弱消毒处理时消毒液对生长点分生细胞的伤害。先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3?4次，然后用加有2?4滴吐温80的0.Γθ.2%的升汞液浸泡15?30分钟，用无菌水冲洗至无残留无异味。
[0045]第二步:在步骤a中消毒所得到的无菌外植体接种到初代培养基MS+6-BA0.15?0.25 mgl/1+ 奈乙酸(NAA)0.15?0.25mgL-1+ 蔗糖 25?35gL-1+ 琼脂 4?8gL' 培养基PH调为5.8左右，一个试管接种一个，避免交叉感染，于光周期为12h/d，光照强度为20001x，培养温度为25°C的无菌室内培养25天左右开始萌发。
[0046]无菌操作室在使用前30分钟，打开紫外灯和超净工作台，紫外灯在关闭10分钟后，才可进行接种操作；接种用具在121°C条件下高压灭菌35分钟，培养基在121°C条件下高压灭菌18分钟。
[0047]第三步:将初代培养获得的健壮一致的无菌苗转到增殖培养基MS+6-苄氨基嘌呤(6-ΒΑ)0.Γ2.SmgL—1+奈乙酸(NAA)0.Γθ.SmgL—1+蔗糖 25?SSgL—1+琼脂 4?SgL—1。结果表明，大叶蚁塔增殖需要一定浓度的细胞分裂素，当6-苄氨基嘌呤(6-BA)为0.1mgr1时，增殖速度非常缓慢，当6-苄氨基嘌呤(6-BA)浓度为lrngL—1时，对大叶蚁塔丛生芽的增殖效果最好，而当浓度达到2.Smgr1时，大叶蚁塔出现玻璃化、僵化的畸形现象。添加生长素奈乙酸(NAA) 0.1 mgr1时，对大叶蚁塔的增殖有促进作用，生长素奈乙酸(NAA)浓度超过0.2mg^1时，基部又容易形成大块的愈伤组织，阻碍试管苗吸收营养，选定MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)Imgr1 +奈乙酸(NAA)0.1mgr1+蔗糖3(^171+琼脂egL—1培养基为大叶蚁塔增殖的最佳培养基，在该培养基上产生的丛生芽发育正常，叶色浓绿，长势旺盛，无玻璃化现象，可以做为大叶蚁塔扩繁增殖的培养基。
[0048]第四步:大叶蚁塔试管苗高度小于0.5cm的，诱导分化率低，高度为2cm的分化效果好，但因其长势快，需采用容积较大的培养瓶，由此增加了生产成本，与分化出的种苗大小不一，为生根操作增加分拣工序，因此尝试叶盘法诱导不定芽分化。叶盘法诱导不定芽培养基为MS+玉米素(ZT)0.15?2.SmgL-1+奈乙酸(NAA)0.1?0.SmgL^1+蔗糖25?35 g^1+琼脂4^8 gL'玉米素(ZT)在0.15^2.5 mgL—1的浓度范围内，接种1d即观察到叶片边缘卷曲，逐渐形成瘤状突起，30d成为可见的不定芽，培养基MS+玉米素(ZT)L O mgL—1+奈乙酸(NAA)
0.1 mgr1+蔗糖SOgr1+琼脂egL—1诱导率最高达到95%。每片叶盘上可以再生出10?15株数量不等，但整齐细小的试管苗，由此每瓶可容纳50?100株试管苗，再把此试管苗用做生根培养，操作简单，试管苗整齐均一，成本大大降低。在叶盘法诱导不定芽发生的培养过程中，培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选20001x，培养温度优选25°C，培养周期优选20天，试管苗长至0.5cm高，比较整齐可以用来诱导生根。
[0049]第五步:本发明中生根培养基为1/2MS+奈乙酸(NAA)0.1?2.5mg吨―1+蔗糖15?25g.Γ1+琼脂4?8g.L'挑选叶盘法分化诱导的不定芽，高度控制在0.5cm左右，转接入生根培养基。大量元素减半的1/2MS比MS更有利于生根，降低蔗糖含量至20g.L-1时，也能够提高生根率及平均生根数。当奈乙酸(NAA)浓度为0.5mg -Γ1时，生根率比较低；当上调至2.5mg.L-1时，生根率虽然可以达到100%，但是在试管苗的基部容易出现愈伤化组织，不利于后期的移栽；当奈乙酸(NAA)浓度为Img.L-1时，生根率最高达到95%，每株试管苗上诱导生成的根多达10条，基部无愈伤组织生成，并且其根尖部分为红色，证明其分生细胞分裂活跃，生命力旺盛，吸收营养迅速，是该植物生长健壮的原因所在。大叶蚁塔试管苗最适生根培养基确定为1/2MS+奈乙酸(NAA) Img.L-1+蔗糖20g.L-1+琼脂6g.L-1。培养条件为无菌室内光周期优选12h/d，光照强度优选20001x，培养温度优选25°C，生根培养的周期优选30天。由此生根率最高可达95%，诱导生成的根数量众多。
[0050]第六步:将大叶蚁塔生根试管苗置于自然环境中6?10天，一般为一周，取出洗净，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，本发明中草炭土:珍珠岩:腐殖质=1:1:1,起始30天内采用喷雾保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，待萌发新根后，逐渐加强光照至全光照。大叶蚁塔成活率可以达到90%。试管苗移栽第4个月时，植株老叶逐渐褪去，萌发出了新叶，较之刚出瓶的试管苗，叶片厚度加大，在常规管理下，已能安然生长，有望在上海以及长三角各处推广试种。移栽成活4个月的试管苗，新叶厚度加大。
[0051]采用本发明所提供的方法，对加快大叶蚁塔的繁殖速度，是一种很有效的途径，一旦得到无菌苗后，可以利用无菌苗进行增殖培养，并取其叶片诱导个体较小的不定芽，不定芽生根和移栽成活后，即再生为完整植株，形成了一个良好的生产体系。年繁殖系数由自然状态下的1:1，提高到1:1000000，成本由原来的每株8(Tl00元，降低至每株广2元。提供了一种周期短，繁殖系数高、生产步骤衔接紧密、成本低廉的大叶蚁塔组培育苗方法。生产得到的大叶蚁塔种苗品质高，一致性好，并且从幼苗开始驯化，能逐步适应上海的土壤气候条件，具有广阔的市场前景。
[0052]总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
【权利要求】
1.一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，包括下列步骤:取大叶蚁塔无菌外植体，在无菌环境下，经初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养、生根培养，获得生根试管苗，进行栽种。
2.根据权利要求1所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于，所述的初代培养为:选择并清洗、消毒处理大叶蚁塔茎尖获得起始的无菌外植体，接种到初代培养基上，进行初代培养，获得无菌苗； 增殖培养:是将初代培养的无菌苗转入增殖培养基，诱导丛生芽； 叶盘法诱导不定芽培养:取诱导出丛生芽的无菌苗的幼嫩叶片，转移至不定芽诱导培养基培养，诱导出不定芽； 生根培养:将叶盘法诱导分化的不定芽，从叶盘上切下，取高度为0.5cm左右，转移至生根培养基中，获得生根试管苗； 最后，对所得的生根试管苗进行清洗，移至珍珠岩、草炭土、腐殖质的混合基质中进行栽种。
3.根据权利要求1或2所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于:所述的大叶蚁塔无菌外植体的获得方法为:取大叶蚁塔肥厚的茎尖，切取成为长度0.5^1cm,直径为0.3^0.6cm的圆柱体，并使顶芽生长点位于圆柱体的中央，保留两片叶柄基部，保护生长点，用洗洁精擦洗表面，流水冲洗20分钟，再进行消毒处理；消毒处理方法是:先用72%浓度的酒精消毒3(T60s，再用无菌水冲洗3?4次，然后用加有2?4滴吐温-80(油酸酯)的0.Γ0.2%的升汞液浸泡15?30分钟，无菌水冲洗至无残留，得到无菌外植体。
4.根据权利要求2所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于:所述的增殖培养基为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.Γ2.Smg*^1+奈乙酸(NAA)0.1?0.Smg.L—1+ 蔗糖 25?358.171+ 琼脂 Og-L^10
5.根据权利要求2所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于:所述的叶盘法诱导不定芽培养基为15+玉米素(21')0.15^2.Smg.!/1+奈乙酸(NAA)0.1?0.Smg.L—1+ 蔗糖 25?35 g.L—1+ 琼脂 4?8 g.L-1。
6.根据权利要求2所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于:所述的生根培养基为:1/21^+奈乙酸(應八)0.Γ2.Smg.L—1+蔗糖15?258.171+琼脂4?Sg.L—1。
7.根据权利要求1或2所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于:所述初代培养基为:MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA) 0.15^0.25mg*r1+奈乙酸(NAA)0.15?0.25mg*r1+ 蔗糖 25?358.!^+ 琼脂 4?8g.L'
8.根据权利要求1或2所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于:所述的初代培养、增殖培养、叶盘法诱导不定芽培养和生根培养的培养条件均为无菌环境，光周期为l(Tl5h/d，光照强度150(Γ25001χ，培养温度为室温，初代培养的周期为22?28天，增殖培养的周期为28?32天，叶盘法诱导不定芽发生培养的周期为If 22天，生根培养的周期为28?32天。
9.根据权利要求1或2所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于:所述的生根培养步骤中:将生根试管苗置于自然环境中6?10天，取出洗净根部，用50(Γ600倍托布津水溶液浸泡数秒，移栽到草炭土、珍珠岩和腐殖质的混合基质中，起始30天内保持苗的叶面湿润，相对湿度为95%左右，并适当遮阳，待新的根系发育完整后，再逐渐降低湿度，加强光强至全光照。
10.根据权利要求2所述的一种大叶蚁塔离体培养和快速繁殖的方法，其特征在于:所述的生根试管苗移栽入混合基质的营养成分为草炭土:珍珠岩:腐殖质=1:1:1。
【文档编号】A01H4/00GK104221851SQ201310225256
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年6月7日 优先权日:2013年6月7日
【发明者】吕秀立, 钱又宇, 崔心红, 张群 申请人:上海市园林科学研究所