用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的菌株的制作方法
【专利摘要】本发明属于微生物应用技术和食品生物【技术领域】，公开了用米糠麸皮全料液态培养基生产多糖的灵芝菌株。灵芝JSU6161314已于2013年6月25日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，编号为CCTCC?M2013287，名称为灵芝CCTCC?M2013287(Ganoderma?lucidum?CCTCC?M2013287)。本发明通过附图方法，由灵芝CFCC6043出发得到能高产灵芝多糖的所述新菌株。该新菌株在米糠麸皮全料液态新培养基中快速发酵并高产灵芝多糖，上罐发酵的菌丝干重和菌丝多糖产率较出发菌株增加了23.0％和45％。
【专利说明】用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的菌株
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品微生物应用【技术领域】，尤其涉及一株适合在米糠和麸皮全料复合液态培养基中生长并高产灵芝多糖的灵芝菌株的新诱变菌株。
【背景技术】
[0002] 自从 Chihara 等人(参考文献:Chihara G, MaedaY, Hamuro J, et al.1nhibitionof mouse sarcomal80by polysaccharides from Lentinus edodes(Berk.)sing[J].Nature, 1969，222 (5194):687-688.)于1969年在《Nature》上发表论文，揭示香菇多糖具有抗肿瘤活性以来，已经发现具有抗肿瘤活性的药用真菌达两百多种，其中一部分还是食用真菌，如灰树花、猴头菌、灵芝等。这些食用菌的菌丝体、子实体、菌核或孢子中能产生诸如氨基酸、蛋白质、维生素、多糖、苷类、黄酮类及抗生素等多种活性成分或富集微量元素硒、锌等，具有提高人体免疫力、抗肿瘤、增强肝功能、抗氧化等多种功效。国内市场已有食用菌保健食品如灵芝胶囊、灰树花胶囊及冬虫夏草胶囊等在热销。国际上新西兰、日本、美国等均产有类似的产品。新西兰的“GanoPoly”系列产品由灵芝、云芝等提取的多糖复合壳聚糖而成，主要用于提高免疫力、辅助抗肿瘤治疗等方面。就灵芝多糖而言，针对其的研究表明:灵芝多糖具有良好的提闻免疫力、辅助抗肿瘤治疗等疗效，例如Huang、Seto等从灵芝菌体中提取灵芝多糖的药效试验表明，灵芝多糖具有免疫调节作用和抗肿瘤作用(参考文献见
①Huang S.Q.,Ning Z.X.Extraction of polysaccharide from Ganoderma lucidum andits immune enhancement activity[J].1nt J Biol Macromol，2010，47 (3):336 ~341 ;
②Seto S.ff., Lam T.Y, Tam H.L., et al.Novel hypoglycemic effects of Ganodermalueidum water-extract in obese/diabetic(db/+db)mice[J].Phytomedicine,2009,
(16):426 ~436 ;③ Hikino H, Konno C, Mirin Y, et al.1solation and hypoglycemicactivity of ganoderans A and B, glycans of Ganoderma lucidum fruit bodies[J]。Planta Med，1985， (12):339 ~340)
[0003]灵芝(Ganoderma Iuccidum)别名芝草、瑞草,是真菌门,担子菌亚门,层菌纲,非裙菌目，灵芝菌科，灵芝属真菌，主要分布于亚洲、澳洲、非洲和美洲的热带及亚热带地区，少数也分布于温带地区，地处北半球温带的欧洲仅有灵芝属的4种，而北美洲大约5种。中国地跨热带至寒温带，灵芝科种类多而分布广，是世界灵芝属真菌物种多样性最丰富的国家之一。传统上，灵芝的获取方式主要是人工栽培或野外采集，以子实体或孢子粉入药。但人工栽培灵芝周期长、生产效率低、劳动强度大，又受季节、环境等限制，易遭病虫害，质量与产量不稳定，而野外采集灵芝数量有限，难以满足大生产要求。食用菌液体深层发酵技术，比传统的子实体栽培法具有明显的优势。为高效生产灵芝多糖，研究人员十分重视对促进工业化生产的液体培养方法的研究，获得了许多研究成果。組晓艳、曾晓希等对灵芝液态培养的条件进行了研究，此类研究的主要内容涉及生产菌种、培养基成分和发酵工艺参数，将降低生产成本以及提高多糖产量作为研究重点。其中多数工艺采用如淀粉、马铃薯、葡萄糖等作为培养基成分，即便利用到农产品加工副产品如米糠或者麸皮，也是将其作为次要成分，仍是以粮食类原料、葡萄糖、或其他原料为主要碳源和氮源。[0004]中国是农业大国，农副产品来源丰富。米糠、麸皮作为稻谷和小麦加工的副产物，不但其营养成分丰富，而且价格低廉。米糠中富含淀粉、纤维素等物质，而麸皮富含蛋白、纤维素等物质。从理论上讲，米糠和麸皮复合已经具备了灵芝生长所需要的碳源和氮源物质。在灵芝自身纤维素酶及其他酶的作用下，灵芝可将米糠和麸皮转化成自身的营养物质进行生长，生产灵芝多糖。因此，运用米糠、麸皮等廉价农副产品，完全替代葡萄糖等灵芝液体发酵所需的营养物质，生产具有辅助肿瘤治疗的灵芝糖，对低端原料的高值化应用具有重要意义，具有极高的经济价值。
[0005]根据本专利发明人刘伟民课题组多年的研究经验，一些食用菌菌株在不添加葡萄糖或者其他粮食类原料的米糠或麸皮液态培养基上生长状况并不太理想，需要作特殊处理如菌种诱变以获得良好的生长。例如，刘伟民指导多名硕士研究生对食用菌灰树花液态发酵米糠或麸皮进行过深入的研究，获得了一些成果，形成如下文献:(I)杨锁华.灰树花发酵米糠制备多糖[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学.2006 ; (2)顾慧敏.灰树花在米糠培养基中液态培养产多糖和富集有机硒的研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学.2009 ；
(3)张建.物理法诱变灰树花液体发酵米糠麸皮产多糖的研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2010 ; (4)郭春梅.灰树花的菌种诱变、液体发酵米糠麸皮产多糖及富硒研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2011 ; (5)李永转.转化米糠和麸皮高产多糖的灰树花菌株诱变和已有菌的发酵试验[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2012 ; (6)刘伟民，张建，郭春梅，等.用于米糠和麸皮复合原料生产多糖的灰树花菌株[P]，10579078.5，2010 ； (7)刘伟民，张建，郭春梅，等.使用米糠麸皮复合原料和灰树花诱变菌株生产多糖的方法[P] ,1010579048.4，2010 ; (7)刘伟民，郭春梅，张建，等.用于发酵米糠和麸皮提取液生产灰树花多糖的菌株[P]，10150888.3，2011(申请)；(8)李亚楠.灰树花菌种诱变及发酵和产物性能研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2013 (该论文
【公开日】期为2013年6月，与本专利的申请提交年月相同)；(9)赵莉.灰树花在米糠麸皮复合培养基中液态发酵富集锰的研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2012 ; (10)刘丽丽.高值转化米糠麸皮的灵芝液体发酵及菌种诱变[D].硕士学位论文。镇江:江苏大学，2012 ; (11)郭天龙.灵芝菌种诱变及液态发酵高值化转化全米糠麸皮研究[D].硕士学位论文.镇江:江苏大学，2013(该论文
【公开日】期为2013年6月，与本专利的申请提交年月相同)。
[0006]由上述参考文献可知，本专利发明人刘伟民一直围绕米糠麸皮高效高值化转化为珍稀食用菌多糖这一专题进行研究，实现多个发明创造设想，并提出了用灵芝进行米糠麸皮全料液体发酵，高效高值化转化米糠麸皮为灵芝多糖的研究思路，对原始菌株加以诱变处理，在指导刘丽丽诱变试验不成功(为负诱变，见刘丽丽硕士论文P46对表5.2的分析，刘丽丽的硕士论文全部采用米糠麸皮过滤取汁作培养基，不是本发明的米糠麸皮全料液态培养基)的基础上，总结经验，再指导郭天龙进行系统的研究，得到了正诱变菌株，并新提出了诱变菌株液态发酵米糠麸皮全料，高效高值化转化米糠麸皮为灵芝多糖的方法，形成了本发明专利和同时申报的另一个发明专利的内容。郭天龙的硕士论文
【公开日】期为2013年6月，与本专利的申请提交年月相同，不影响本发明的新颖性。
[0007]本发明的关键问题之一为必须得到一种灵芝新菌株，此新菌株能在米糠麸皮全料液态培养基上有效生长并高效转化米糠麸皮全料为灵芝多糖。新菌株的建立及新菌株对米糠麸皮的新利用方式都需要创新，适合于新灵芝菌株的米糠和麸皮组成液体培养基的配比及液态发酵的工艺条件均需新研究得出，还未见报道，因此本发明具有独特、创新和实用性，具备发明专利的基本特征。
[0008]目前微生物的物理选育方法主要有紫外诱变、微波诱变、离子束诱变等。为了诱变筛选出适合在全米糠麸皮复合培养基上生长并产多糖的灵芝菌株，本发明采用简单的物理诱变方法，同时进行紫外诱变和微波诱变试验，扩大被试灵芝出发菌株突变的位点范围，提高得到正突变菌株的可能性。本发明诱变得到的适合在全米糠麸皮复合培养基上生长并产灵芝多糖的菌株为首次发明得到。
【发明内容】
[0009] 本发明为了减少使用土地和降低生产周期，降低生产成本，将低端原料加以高值化转化利用，最终能降低灵芝多糖产品价格，惠及大众，考虑采用大宗农产品稻谷和小麦加工的副产品米糠和麸皮作为培养基，不再添加其他碳源如葡萄糖和氮源，进行灵芝的液体发酵，生产灵芝多糖。要实现此目的，需要诱变筛选出在米糠麸皮全料液态培养基上适宜生长的灵芝菌株。因此，本发明将通过紫外、微波诱变的方法，以高产多糖为指标，定向转化米糠麸皮为基础，选育出高产、低成本的灵芝菌株。通过一系列的稳定性、遗传性等筛选方法的建立，保证灵芝的优良性状，为进一步大规模利用低成本的米糠和麸皮生产高价值的灵芝多糖奠定基础。
[0010]本发明所采取的技术方案如下:
[0011]本发明由中国林业微生物菌种保藏管理中心(CFCC)的灵芝CFCC6043 (Ganodermalucidum CFCC6043)出发，通过紫外和微波的诱变筛选，提供一种新灵芝诱变菌株灵芝JSU6161314 (Ganoderma lucidum JSU6161314)，可以在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮全料液态培养基上具有高生长速率和高多糖产量；该灵芝JSU6161314已经于2013年6月25日保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株编号为CCTCCM2013287，名称为灵芝CCTCC M2013287 (拉丁名为 Ganoderma lucidum CCTCC M2013287)。
[0012]在本发明的一个方面中，提供上述灵芝CCTCC M2013287的用途，用于发酵米糠麸皮全料液态培养基生产灵芝多糖。
[0013]本发明的有益效果
[0014]本发明采用简单的物理诱变技术紫外和微波诱变技术选育灵芝高产菌株，由实验室现有的灵芝CFCC6043出发，进行紫外和微波并行诱变，以生长速率、菌丝干重和胞外多糖为指标进行筛选，最终获得灵芝CCTCC M2013287，在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮全料液态培养基中生产灵芝产多糖，与原始菌株灵芝CFCC6043相比产量更高，由微波诱变菌株所得菌株灵芝CCTCC M2013287上罐发酵时菌丝干重和菌丝多糖产率产量为
6.3g/100mL培养基和0.203mg/100mL培养基，出发菌株灵芝CFCC6043菌丝干重和菌丝多糖产量为5.12g/100mL培养基和0.14mg/100mL培养基，诱变菌株灵芝CCTCC M2013287发酵的菌丝干重和菌丝多糖产率比出发菌株灵芝CFCC6043的菌丝干重和菌丝多糖产量分别增加了 23.0%和45%。经过灵芝CCTCC M2013287与出发菌株灵芝CFCC6043的拮抗试验证明诱变后的菌株与出发菌株在遗传特性上有所不同，筛选时诱变菌株灵芝CCTCC M2013287生长特性明显快于出发菌株灵芝CFCC6043，从而可以判定诱变菌株为所希望的新菌株。此新菌株灵芝CCTCC M2013287为首创得到，属于一种新的微生物资源，具有独特性、创新性。以新菌株灵芝CCTCC M2013287为基础，形成了新的发酵米糠麸皮全料液态培养基的方法，该方法改变了以往米糠麸皮过滤取汁或纤维素酶处理后取汁使得米糠麸皮利用率低的缺点，高效利用了廉价的米糠麸皮，可以降低生产成本，减少资源消耗，增加产量。所述诱变株灵芝CCTCC M2013287在相同的米糠麸皮使用量条件下，诱变菌株灵芝CCTCC M2013287发酵的菌丝干重和菌丝多糖产率比出发菌株灵芝CFCC6043的菌丝干重和菌丝多糖产量分别增加了 23.0%和45%，增产效果显著。本发明产生了技术进步的有益效果。[0015]最终产品为具有增强免疫力、辅助肿瘤治疗等功效的灵芝多糖，可以成为大众保健的有益产品。将低端原料高值化转化利用，节约了成本和资源。因此，本发明具有良好的社会效益。
[0016]终端产品灵芝多糖目前在市场上价格较高，为高值化产品，本发明具有良好的经济价值。
[0017]综上，本发明已经具备了发明专利的独特性、创造性和实用性，产生了有益技术、社会和经济效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为本发明菌株紫外微波并行诱变选育方法的流程图；
[0019]图2为紫外照射效果，其中注:左边为照射Os，右边为照射90s ；
[0020]图3为微波照射效果，其中注:左边为照射Os，右边为照射IOs ；
[0021]图4为菌株生长状态，其中注:从左至右依次为紫外9号、灵芝CCTCC M2013287、出发菌株；
[0022]图5为菌株液体种子形态比较，其中注:从左至右依次为出发菌株、紫外9号、灵芝CCTCC M2013287 ；
[0023]图6为诱变株灵芝CCTCC M2013287与出发菌株灵芝CFCC6043的拮抗图，其中注:左边为原始菌株灵芝CFCC6043，右边为诱变株灵芝CCTCC M2013287。
【具体实施方式】
[0024]本发明按照说明书附图1所示的流程，提供了紫外和微波诱变选育在不加其他碳源和氮源的米糠麸皮复合培养基上具有高生长速率和高多糖产量的灵芝菌株的方法，所述方法包括下列步骤:
[0025]?取实验室现有的灵芝为出发菌株；
[0026]?将灵芝菌株接种于固体斜面培养基上进行正常培养；
[0027]?菌体培养后生理盐水洗脱制得孢子悬液；
[0028]?将上述得到的孢子悬液在紫外灯下照射以及微波辐射进行诱变后，无光暗培养，一次筛选出生长速率较快、比较稳定的菌株；
[0029]?在全米糠、麸皮液体发酵培养基上进行发酵，二次筛选高生长速率和高多糖产量的菌株；
[0030]?进行稳定性和遗传性分析和鉴定；
[0031 ] 在一个实施方案中，所用的固体斜面培养基为马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素BJOmg/L，琼脂20g/L，pH自然。
[0032]在一个实施方案中，所述恒温为28 °C。
[0033]在一个实施方案中，所述紫外诱变采用红光暗操作，以二个功率为30W的紫外灯管作为紫外诱变的光源，距离20cm，照射30s。
[0034]在一个实施方案中，所述无光暗培养为在28°C下无光培养2-3天。[0035]在一个实施方案中，所述无光暗培养所用培养基为米糠、麸皮固体平板培养基:米糠 20g/L，麸皮 30g/L，磷酸二氢钾 1.5g/L，硫酸镁 0.75g/L，维生素 B1IOmgzUI^g 20g/L，pH自然。
[0036]在一个实施方案中，所述筛选方法为平板直径测定法。
[0037]在一个实施方案中，所述微波诱变采用红光暗操作，微波功率700W，脉冲频率2450Hz，诱变时间20s。
[0038]在一个实施方案中，所述一次筛选步骤为:从紫外诱变、微波诱变无光暗培养平板上挑取生长良好的单菌落分别接种至新的米糠麸皮固体平板培养基中，挑选出10株生长速度快且浓密的诱变株，对其传代培养，从中选出3株相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株。
[0039]在在一个实施方案中，所述二次发酵筛选步骤为:初次生长确定的高生长速率变异株作为二次筛选的对象，与出发菌株一起进行发酵筛选从而确定变异株优良性状稳定表达的菌株。将初次筛选菌株和出发菌株进行摇瓶发酵试验，连续发酵5代，按指标确定目的诱变株。
[0040]在一个实施方案中，所述摇瓶为250mL锥形瓶。
[0041]在一个实施方案中，所述米糠、麸皮液体发酵培养基为:米糠20g/L，麸皮30g/L(米糠、麸皮水煮4h不取汁即全利用)，磷酸二氢钾1.5g/L，硫酸镁0.75g/L，维生素BJOmg/L, pH 自然。
[0042]在一个实施方案中，所述指标为胞外多糖、菌丝(混合少量原料)干重和菌丝多糖。
[0043]本发明中转化米糠和麸皮复合原料的灵芝突变株的分析鉴定方法，所述方法包括下列步骤:
[0044]?菌落形态比对；
[0045]?稳定性分析；
[0046]在一个实施方案中，所述为菌落形态比对，将斜面上的出发灵芝菌株和JSU61613菌株接种到固体斜面培养基上，各6个重复，在28 °C恒温培养箱中培养7天，每天观察一次，观察包括菌落的生长速度、颜色、菌落形状、气味等。
[0047]在一个实施方案中，所述稳定性分析为以菌丝生长速度为指标考察稳定性,对最终筛选出10株较优的变异菌株，经5次传代，选出最优的JSU6161314菌株，将该株变异菌株再传代3代，观察菌丝生长速度的变化，从而确定稳定性，并与出发菌株对比。
[0048]在一个实施方案中,所述遗传性分析为拮抗分析。
[0049]实施例1灵芝紫外线-微波诱变
[0050]①孢子悬液的制备
[0051]将灵芝接种在9cm灭好菌的固体培养基平板上培养4d后用IOmL无菌生理盐水冲洗，用灭菌的毛笔来回扫刷营养体，收集洗液即得。
[0052]②紫外诱变效应曲线及紫外线诱变剂量的选择
[0053]取20个9cm平皿，每皿分别装有新制备的孢子悬液5mL。每两个为一组，共分为10组。分别照射0、5、10、15、20、25、30、45、60、150s(90s照射效果见附图2)，然后每皿取ImL适当稀释后涂平板。平板用黑布包裹后置于黑暗闭光的28°C恒温箱培养。待平板长出菌落后，菌落计数。每组以两个皿菌落数的平均值作为该组的菌落数。计算诱变致死率，以诱变致死率为指标选择紫外线诱变剂量。
[0054]
诱变致死率=X100%
B
[0055] 式中，A为诱变后菌落再生数；B为诱变前菌落数。
[0056]③紫外诱变
[0057]打开紫外线预热约20min，取直径9cm无菌培养皿2套，分别加入上述调整好的孢子悬液5mL，并放入震动器上，打开板盖，在距离为20cm，功率为30W的紫外灯下按上述选择最佳照射剂量分别照射。盖上皿盖，关闭紫外灯。照射计时从开盖起，加盖止。先开震动器开关，再开盖照射，使孢子悬液中的细胞接受照射均匀等。
[0058]④微波诱变
[0059]吸取制得的孢子悬液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的悬液量为10mL，调整微波功率为700W，脉冲频率为2450Hz，按照不同的处理时间，对孢子悬液进行辐照处理(IOs照射效果见附图3)。吸取孢子悬液0.3mL，涂布米糠、麸皮固体平板培养基，然后置于28°C恒温箱培养3d。活菌计数，计算致死率。连续诱变10批，挑选在米糠麸皮培养基上能最先生长出来、健壮、纯正的菌株。
[0060]④诱变菌株的筛选
[0061]取紫外照射、微波辐射的菌悬液0.2mL，用无菌玻璃涂棒均匀地涂满米糠、麸皮固体平板培养基表面，每批涂5个平皿，诱变10批，将再生的单菌落分别接种至新的平皿中，挑选出10株生长速度快且浓密的诱变株,对其传代培养,从中选出3株相对于出发菌株生长快、形状好、稳定性高的菌株。
[0062]将上述灵芝诱变株进行摇瓶发酵试验，以胞外多糖、菌丝混合干重为指标，筛选出目的诱变株。
[0063]表1选出菌株各代发酵菌丝混合干重
[0064]
【权利要求】
1.用于米糠和麸皮全料液态发酵生产灵芝多糖的菌株，其特征在于保藏于武汉中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)的灵芝CCTCC M2013287 (Ganoderma lucidum CCTCCM2013287)。
【文档编号】A01G1/04GK103477994SQ201310274915
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】刘伟民, 郭天龙, 沈国栋, 张笑飞, 周文彪, 赵杰文, 马海乐 申请人:江苏大学