一种诱导糖尿病模型的建立方法
【专利摘要】本发明适用于医学领域，提供了一种诱导糖尿病模型的建立方法，所述方法包括：实验动物总量的5/6只雄性猴，年龄7-20岁，采食猴高脂饲料，主要成份为18％蛋白质，60％糖类，22％脂肪；实验动物总量的1/6只雄性猴，年龄4-10岁，喂食猴标准饲料，主要成份为18％蛋白质，69％糖类，3％脂肪。本发明采用长期膳食诱导糖尿病的模型建立可以解决由药物造模不能真正很好的模拟人类糖尿病发展的长期缓慢进程及由此引起的全身机体变化的问题，科学性较强。
【专利说明】一种诱导糖尿病模型的建立方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学领域，尤其涉及一种诱导糖尿病模型的建立方法。
【背景技术】
[0002]目前，糖尿病的研究所采用的动物多为大、小鼠，造模方法有自发和化学诱导等方法。目前糖尿病研究多采用啮齿类动物模型，但啮齿类与人类的亲缘关系较远，且寿命短，因此，并不适于糖尿病机理及其并发症的研究。在非灵长类动物中，无论是自发性、链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)化合物诱导、基因突变、或者其他途径获得的糖尿病模型都有I型和2型糖尿病动物模型的报道。所有种类的动物模型中，在非人灵长类动物模型中观察到的血糖规律、病理特征与在人类糖尿病患者中观察到的临床特征最为相似。
[0003]现有技术中，在链脲霉素诱导高血糖动物模型中，选用动物，常用小鼠或大鼠，也可选用兔、犬及猴等，配制不同浓度或单一浓度的STZ水溶液，采用静脉或腹腔注射方式单次或多次重复给药。经过不同处理时间后检测是否成模。分别在注射STZ前，给药后不同时间(一般2-6个月，有I年时间)进行血糖值测定、葡萄糖耐量实验和血清胰岛素或C肽检测，频率均有不同，并观察记录动物的体重变化和临床症状。
[0004]在链脲霉素诱导高血糖动物模型中，存在以下问题:
[0005](1)采用的STZ在不同动物，甚至不同报道中诱导糖尿病所需要的剂量不尽相同，高剂量STZ会引起造模动物死亡，低剂量STZ难于成模，或者成模后很快就转阴。另外，STZ注射方式(腹腔、静脉注射)等对造模也有一定影响。因此，采用STZ造糖尿病动物模型时一定要选用适合的剂量和注射方式，一方面降低STZ的毒副作用；另一方面提高STZ成模的稳定性。很难掌握，缺点突出。
[0006](2)由药物STZ引起的胰岛损伤并不能真正很好的模拟人类糖尿病发展的长期缓慢进程及由此引起的全身机体变化，因此用于相关研究的科学性尚不足。
[0007](3)目前报道的STZ诱导的非人灵长类动物糖尿病为I型糖尿病，未见诱导2型糖尿病的报道，且多用作胰腺细胞的异种移植受体，极少用于新药评价中。
[0008](4)在非人灵长类动物糖尿病造模的时间上还不长，有待进行更长期的研究以确定模型的稳定性与时相转化。
[0009]另外，在食物诱导非人灵长类糖尿病模型中，Wagner等给45只食蟹猴饲喂高碳水化合物和低胆固醇的食物[18%蛋白、22%的脂肪、60%碳水化合物(果糖含量达20% )]。虽然大部分食蟹猴的空腹血糖值保持正常，但糖耐量检测发现，其血糖浓度和胰岛素含量在个体中的差别很大。那些具高胰岛素(HyperinSul inemic, HI)的8只猴子或者糖耐量受损(impaired glucose tolerant, IGT)的10只猴子空腹血糖浓度和胰岛素含量显著地升高。同时具有高血糖和糖耐量受损的5只猴子(HI+IGT)出现肥胖，体重比对照组猴子多40%，这组猴子的廋素浓度也高。与正常食物饲喂的其他猴子相比，所有上述猴子具高血脂和低HDLC，其中HI+IGT组猴子的值最高。一年后，10只IGT猴子中的I只和5只HI+IGT猴子中的3只发展为糖尿病。[0010]在食物诱导非人灵长类糖尿病模型中，存在下述问题:
[0011](I)使用的动物为食蟹猴，该猴为热带猴，国内主要集中在广西、广东、海南三省，受气候环境、资源条件的影响非常大。所以急需建立其他亚种的糖尿病模型动物。
[0012](2)现有技术造模的时间在I年内，还不能很好地观察到模型的发展进程和变化。[0013](3)动态监测的频率还不够，稳定的模型需要不同时间段的更加稳定的检测指标来支持。
[0014](4)该类非人灵长类糖尿病模型在国内还未见报道。
【发明内容】
[0015]本发明实施例提供了一种诱导糖尿病模型的建立方法，旨在解决现有技术药物造模中毒副作用强，稳定性差的问题。
[0016]本发明实施例是这样实现的，一种诱导糖尿病模型的建立方法，所述方法包括:
[0017]实验动物总量的5/6只雄性猴，年龄7-20岁，采食猴高脂饲料，主要成份为18 %蛋白质，60%糖类，22%脂肪；实验动物总量的1/6只雄性猴，年龄4-10岁，喂食猴标准饲料，王要成份为18%蛋白质，69%糖类,3%脂肪。
[0018]本发明实施例采用长期膳食诱导糖尿病的模型建立可以解决由药物造模不能真正很好的模拟人类糖尿病发展的长期缓慢进程及由此引起的全身机体变化的问题，科学性较强。
【具体实施方式】
[0019]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0020]本发明实施例采用长期膳食诱导糖尿病的模型建立可以解决由药物造模不能真正很好的模拟人类糖尿病发展的长期缓慢进程及由此引起的全身机体变化的问题，科学性较强。
[0021]在本发明实施例中，实验动物为60只雄性恒河猴川西亚种(M.m.1asiotis)，普通级，年龄4-20岁，体重5-18kg，由国家(四川)实验用猕猴种源基地提供，合格证号:22。喂食高脂饲料前，所有动物空腹血糖(FPG) ^ 5mmol/L.试验前检疫合格，内容包括体检，2次结核杆菌试验、寄生虫、沙门氏菌、致贺氏菌和B病毒检查。不锈钢猴笼中饲养，4只/笼，饲养室温度和湿度:19-26°C (66-79° F)和50±20% ;换气次数:10次/h，保证12( H )/12(夜)h的光照周期。
[0022]在本发明实施例中，试验监测周期为2年，每日上午自由摄取实验猴饲料250g，下午4点给予I个苹果或等量蔬菜。50只雄性猴，年龄7-20岁，采食猴高脂饲料(饲料详细配方暂时略，需要再提供)，主要成份为18%蛋白质，60%糖类，22%脂肪；10只雄性猴，年龄4-10岁，喂食猴标准饲料，主要成份为18%蛋白质，69%糖类，3%脂肪。
[0023]在本发明实施例中，饮用水为自来水，经自动饮水嘴自由摄取。水样需分析可溶性固体总量、硬度、特殊微生物含量、选择的元素、重金属、有机物以及氯代烃含量。结果记录在档案中。动物福利符合“the Nat i onal Inst i tutes of Health Guide for theCare and Use of Laboratory Animal ”要求,所有实验方案都经过中心动物福利和使用委员会的审查和同意。
[0024]在本发明实施例中，采用的仪器为全自动生化分析仪(SYNCHRON CX4PR0)、Shimadzu CL-8000全自动生化分析仪、分光光度计，全自动高压灭菌锅(HVE-50，Hirayama) > Sigmal-15 普通离心机(Sigma 公司)、微量移液器(10 u L>200 u L> 1000 u L) >涡旋振荡器、恒温水浴锅、低温冰柜(海尔电器)>725型超低温冰柜(Themo Forms公司)、梅特勒-托利多XK3123(METTLER TOLEDO)大动物天平等。
[0025]在本发明实施例中，诱导糖尿病模型的建立方法详述如下:
[0026](1)体重和体重指数(BMI)检查
[0027]在本发明实施例中，两年试验期，60只动物每日观察一般状况及饲料消耗情况；于高脂饲料诱导前，诱导后每月测定体重和体长变化。以体重除以体长平方计算BMI。本次试验中采用人肥胖分级来诊断猴:偏瘦(BMI ( 18.5)、正常范围(BMI:18.5-25)、偏胖(BMI:25-30)、肥胖(BMI ≥ 30)。
[0028](2)空腹血糖(FPG)、空腹血浆胰岛素(FPI)和糖化血红蛋白检查
[0029]在本发明实施例中，60只动物于高脂饲料诱导前I次，诱导后第2月、3月、5月、7月、10月、11月、12月、15月、16月、18月、19月、20月、22月、24月于禁食后16小时后肢股静脉采血，分析空腹血糖和空腹血浆胰岛素水平；于高脂饲料诱导24月检测HbAlc。
[0030]在本发明实施例中，空腹血糖(FPG)检测采用贝克曼库尔勒全自动生化分析仪(SYNCHRON CX4PR0)测定血糖，测定用血不抗凝，测定方法为过氧化酶终点法。
[0031]在本发明实施例中，空腹血浆胰岛素(FPI)检测采用双抗夹心酶联免疫吸附法。
[0032]①自备物品:酶标仪提前预热，微量加液器及吸头、EP管、蒸馏水和滤纸。
[0033]②样品处理:全血标本于室温放置2小时后1000 Xg离心20分钟，取上清，蒸馏水稀释10倍待测。
[0034]③操作步骤:
[0035]a.96孔板分别设空白孔、标准孔和待测样品孔，分别加入IOOyl样品稀释液、标准品和待测样品，加覆膜37°C温育2小时；
[0036]b.弃去上清，甩干，每孔加检测液A工作液lOOiU，加覆膜37°C温育I小时；
[0037]c.弃去上清，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约每孔400 U 1，甩干；
[0038]d.每孔加检测液B工作液100 U 1，加覆膜37°C温育I小时；
[0039]e.弃去上清，甩干，洗板5次，同步骤c ；
[0040]f.每孔加底物溶液90 U 1，加覆膜37°C避光显色15-30分钟，当标准孔的前3_4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时即可终止；
[0041 ] g.每孔加终止溶液50 ill，此时蓝色立刻转变成黄色，反应终止；
[0042]h.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的OD值。
[0043]④计算方法:取标准品OD值扣除空白孔OD值后作七点图，以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标)，OD值为横坐标(对数坐标)用curve expertl.3绘制标准曲线；以标准品的浓度与OD值计算标准曲线的回归方程，将样品OD值代入方程式，计算样品浓度，再乘以稀释倍数得样品实际浓度。
[0044]在本发明实施例中，糖化血红蛋白(HbAlc)检测中采用Shimadzu CL_8000fullself-biochemical测定,测定用血用肝素钠抗凝。
[0045](3)静脉注射葡萄糖耐受试验[0046]在本发明实施例中，高脂饲料诱导后24月，60只动物进行静脉注射葡萄糖耐受试验(IVGTT)诊断糖耐量损伤(IGT)。以每千克体重0.5ml服用50 %右旋葡萄糖，使最终剂量达到每千克体重0.25g葡萄糖。先在基线水平检测血糖水平，然后在空腹16小时以后静脉注射葡萄糖分别在1、5、10、15、20和60分钟测定血糖水平。用以下公式计算葡萄糖清除率(Ke):KG = In(5分钟血糖水平)-1n(20分钟血糖水平)/15分钟100%。[0047]在本发明实施例中，采用IVGTT试验分析餐后胰岛素分泌敏感性。高脂饲料诱导后24月，挑选6只FPG正常，2只处于IFG或IGT阶段和I只显性糖尿病阶段猴进行。检测时间点为:先在基线水平检测胰岛素水平，然后在空腹16小时以后静脉注射葡萄糖(方式同前)分别在1、3、5、7、10、15、30、45和60分钟测定胰岛素。血浆胰岛素(FPI)检测采用双抗夹心酶联免疫吸附法。
[0048]在本发明实施例中，在16小时空腹即将结束之前给猴子提供含0.33g/ml葡萄糖的饮料。饮料量以猴子体重来计算供给，猴子只有在20分钟之内喝掉90%的量算试验成功，共服用葡萄糖量大约为每千克体重2g，实际消耗量需经计算。撤走饮料2小时后，采集血液检查2小时胰岛素和血糖水平。
[0049]在本发明实施例中，采用美国糖尿病学会(ADA)和WH02006年糖尿病诊断标准，具体诊断标准为:
[0050]a.典型糖尿病症状(多尿、多饮和不能解释的体重下降)，任意血糖≤11.1mmol/L或空腹血糖(FPG)≤7.0mmoI/L,为糖尿病；
[0051]b.空腹血糖(FPG) < 6.llmmol/L 并且餐后 2h 血糖(2hPG) < 7.77mmol/L,为正常；
[0052]c.餐后 2h 血糖(2hPG) > 1.77臟01/1，但< 11.lmmol/L 时为糖耐量损伤(IGT)；
[0053]d.空腹血糖(FPG)≤6.11臟01/1，但< 6.99mmo/L时为空腹血糖损伤。
[0054]在本发明实施例中，所有数据都采用均值土标准差显示。正态分布的数据经过Tukey-Kramer多重比较检验，差异采用单因素方差分析(ANOVA)进行评估。正态分布数据各组间的差异则采用Kruskal-Wallis非参数检验。所有数据分析都采用NCSS2000软件(NCSS, Kaysvil I e，UT)，所有分析P值小于0.05都认为差异无统计学意义。
[0055]⑷结果分析
[0056]本发明实施例结果为:50只猴采食含22%脂肪饲料24月，8只发展成显性糖尿病，26只猴表现为糖耐量损伤或空腹血糖受损，16只猴表现为空服血糖水平正常；10只喂食含3%脂肪的猴标准饲料24月，空服血糖水平正常。恒河猴川西亚种糖耐量损伤和2型糖尿病发病早期阶段特征表现为肥胖，FPI代偿性增加，餐后葡萄糖清除速度(KGluc5-20)显著降低，餐后胰岛素分泌敏感性下降，第一时相胰岛素分泌减少，第二时相胰岛素分泌延迟；HbAlc随着血糖水平增加而上升；慢性高血糖晚期猴表现为瘦弱、多尿多饮,空腹血糖可大于10mmol/l，HbAlc水平可达8.9%,FPI显著降低,餐后半小时胰岛素分泌增加后迅速降低。HbAlc在4.5-5%之间有发展成2型糖尿病的高风险可能。
[0057]本发明实施例采用长期(2年期)膳食诱导糖尿病的模型建立，符合人类糖尿病发展的长期缓慢进程及由此引起的全身机体变化，且成模后更安全稳定，进行相关研究具有更强的科学性。选用的猕猴川西亚种在四川西部广泛分布，且具有品系纯正，和体型小型化特点，可面向国际国内提供动物模型。[0058]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种诱导糖尿病模型的建立方法，其特征在于，所述方法包括: 实验动物总量的5/6只雄性猴，年龄7-20岁，采食猴高脂饲料，主要成份为18%蛋白质，60%糖类，22%脂肪；实验动物总量的1/6只雄性猴，年龄4-10岁，喂食猴标准饲料，主要成份为18%蛋白质，69%糖类,3%脂肪。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括: 试验监测周期为2年，每日上午自由摄取实验猴饲料250g，下午4点给予I个苹果或等量蔬菜。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括: 两年试验期，所有实验动物每日观察一般状况及饲料消耗情况，并于高脂饲料诱导前、后每月测定体重和体长变化。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括: 所有实验动物于高脂饲料诱导前I次，诱导后第2月、3月、5月、7月、10月、11月、12月、15月、16月、18月、19月、20月、22月、24月于禁食后16小时后肢股静脉采血，分析空腹血糖和空腹血浆胰岛素水平，并于高脂饲料诱导24月检测糖化血红蛋白。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括: 高脂饲料诱导后24月，所有实验动物进行静脉注射葡萄糖耐受试验诊断糖耐量损伤。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括: 采用美国糖尿病学会和WH02006年糖尿病诊断标准。
7.如权利要求1-6所述的方法，其特征在于，所述实验动物选用国家实验用猕猴种源基地的猕猴川西亚种。
【文档编号】A01K67/02GK103478071SQ201310275715
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年6月28日 优先权日:2013年6月28日
【发明者】罗启慧, 陈正礼, 曾文, 程安春, 龚立, 毕凤君, 曾利才 申请人:四川农业大学