一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法

一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法。一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶，利用基因克隆和酵母表面展示技术将一段源自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的木聚糖酶编码基因ORF6-UN展示到酿酒酵母表面上，诱导表达后，离心回收细胞沉淀，经冷冻干燥后得到细胞干粉，该干粉即为瘤胃源全细胞木聚糖酶；木聚糖酶编码基因ORF6-UN的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶可作为饲料添加剂补充到动物日粮中，将这种瘤胃源全细胞木聚糖酶添加到动物饲粮中，不仅能增加动物的营养摄入，还能提高动物对纤维物质的利用效率。
【专利说明】一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]木聚糖是植物细胞壁中常见的半纤维素多糖，占植物碳水化合物总量的1/3，含量仅次于纤维素，是自然界中第二丰富的可利用资源。在养殖生产中，由于单胃动物缺少降解半纤维素的酶，因此木聚糖对单胃动物几乎没有营养作用，而且没有消化的纤维物质会增加食物的黏性，干扰消化酶的作用及营养的吸收；反刍动物由于瘤胃微生物的存在，对木聚糖具有一定的降解能力，但是，实际生产中仍需要补充外源酶制剂，进一步提高动物对粗饲料的消化效率。木聚糖酶是能专一水解木聚糖为低聚木糖和D-木糖的一类糖苷水解酶的总称，由于其在天然材料中表达水平低、生产周期长、酶蛋白提取纯化过程繁琐且成本高，严重限制了它的推广应用。为了满足饲用木聚糖酶的生产需要、开发半纤维类生物能源，利用基因工程技术生产全细胞木聚糖酶具有重要意义。
[0003]酵母表面展示技术是一种固定化的表达异源蛋白质的真核蛋白表达系统，其原理是将外源蛋白基因与载体连接后导入酵母细胞，通过诱导表达，信号肽引导融合蛋白向细胞外分泌。由于融合蛋白含有锚定酵母细胞壁的结构，可将融合蛋白锚定在酵母细胞壁上，从而实现外源蛋白分子固定化表达在酵母细胞表面。酵母生长快、易于培养，展示蛋白在细胞表面稳定且能维持生物活性，加之酵母细胞具有生物安全性，活力强，转入基因在传代细胞中能稳定表达。因此，利用酵母表面展示技术，将木聚糖酶基因导入酵母细胞，经过诱导表达，该木聚糖酶通过二硫键锚定在酵母表面，使重组酵母细胞具有木聚糖酶的催化活性，将这种具有木聚糖酶活性的酵母细胞冷冻干燥，制成干粉，即可得到全细胞木聚糖酶(见图1)。由于固定化的酶无需提取纯化，对降低生产成本有十分重要的作用，加之本方法所用酿酒酵母本身就是一种安全、绿色的高蛋白单细胞食品级微生物，将这种全细胞木聚糖酶添加到动物饲粮中，不仅能增加动物的营养摄入，还能提高动物对纤维物质的利用效率。

【发明内容】

[0004]本发明提供一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶，其添加到动物饲粮中，不仅能增加动物的营养摄入，还能提高动物对纤维物质的利用效率。
[0005]本发明还提供一种所述能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶的制备方法，该方法可以显著简化酵母转化的步骤，缩短反应时间，提高制备全细胞木聚糖酶的效率。
[0006]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0007]—种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶，利用基因克隆和酵母表面展示技术将一段源自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的木聚糖酶编码基因0RF6-UN展示到酿酒酵母表面上，诱导表达后，离心回收细胞沉淀，经冷冻干燥后得到细胞干粉，该干粉即为瘤胃源全细胞木聚糖酶；木聚糖酶编码基因0RF6-UN的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。由于全细胞木聚糖酶是一种固定化的酶，无需提取纯化，简化了生产步骤，对降低生产成本有十分重要的作用。此外，本方法所用酿酒酵母本身就是一种食品级的高蛋白单细胞微生物，因此得到的全细胞木聚糖酶可作为饲料添加剂补充到动物日粮中，将这种瘤胃源全细胞木聚糖酶添加到动物饲粮中，不仅能增加动物的营养摄入，还能提高动物对纤维物质的利用效率。
[0008]一种所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶的制备方法，该方法包括如下步骤:
[0009]a、重组质粒pYDl/0RF6-UN的构建，包含PCR扩增目的基因、目的基因和质粒pYDl的双酶切、连接、转化大肠杆菌、阳性克隆鉴定等步骤；
[0010]b、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EBY100细胞感受态的制备、外源质粒的转化；采用的是PEG/LiAc法进行酵母转化，利用营养缺陷型培养基进行筛选；
[0011]C、酿酒酵母阳性克隆鉴定，采用酵母菌液PCR的方式进行阳性克隆鉴定，模板制备采取的是反复冻融的方法；
[0012]d、重组酿酒酵母细胞EBY100-PYD1/0RF6-UN的诱导表达。先用含2%葡萄糖(glucose)的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物(YNB-CAA)培养基进行培养24_48h,至0D600的在2-5之间时,离心15min,弃上清,用含2%半乳糖(galactose)的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物(YNB-CAA)培养基悬浮细胞进行诱导表达。
[0013]作为优选，步骤a、重组质粒pYDl/0RF6-UN的构建过程具体如下: [0014]①PCR扩增木聚糖酶编码基因0RF6-UN ；
[0015]②用限制性内切酶BamH I和Xho I双酶切目的片段和穿梭质粒pYDl ；
[0016]③构成重组质粒转化大肠杆菌(E.coli) TranslO感受态细胞；
[0017]④鉴定阳性克隆，将阳性克隆单菌落接入LB培养基中扩大培养，抽提质粒pYDl/0RF6-UN。
[0018]作为优选，步骤①中，PCR扩增采用的特异性引物为
[0019]上游引物0RF6-BamH 1:5 ' -TGACGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCCGC-3 ' SEQ IDN0.2，
[0020]和下游引物0RF6_Xho I:
[0021]5' -CACCTCGAGCGCCCCCTCGATATAGACCT-3' SEQ ID N0.3。
[0022]作为优选，步骤d、重组酿酒酵母细胞EBY100-pYDl/0RF6-UN的诱导表达过程具体如下:
[0023]①采用添加了 2%半乳糖的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物(YNB-CAA)培养基进行诱导表达；
[0024]②培养48h后离心取细胞沉淀，经冷冻干燥后得到细胞干粉，该干粉即为瘤胃源全细胞木聚糖酶。
[0025]一种所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶在提高反刍动物对粗饲料的利用率方面的应用，所述的全细胞木聚糖酶按照粗饲料重量的1.5-2.0%进行饲喂。另一种表述是，该全细胞木聚糖酶在瘤胃液中达到2g/L添加量时，可有效提高瘤胃对粗饲料的利用率。经本发明能促进瘤胃发 酵的全细胞木聚糖酶饲喂粗料型反刍动物，产气量以及24h发酵后的总VFA、氨态氮和干物质降解率都显著增加(P〈0.05)，说明该全细胞木聚糖酶的添加对瘤胃发酵具有明显的促进作用，能提高动物对粗饲料的利用效率。[0026]本发明具有下列优点和积极效果:
[0027]1.本方法中所用基因筛选至湖羊瘤胃微生物Fosmid文库。
[0028]2.本方法中所用酵母为酿酒酵母，其为食品级高蛋白的单细胞微生物，具有安全，生长快，活性强等优点，本身可以作为饲料补充到动物日粮中，为全细胞酶的生产提供了必需的条件。
[0029]3.本方法中选择的穿梭质粒是pYDl，它含有AGA2基因，该基因的存在实现了木聚糖酶基因的分泌表达和锚定在酵母细胞壁上；含有Xpress? epitope和V5epitope,可以实现荧光检测展示的木聚糖酶；含有6XHis标签，可以通过它利用western检测展示蛋白以及进行亲和层析纯化；TRP1基因，转化成功的酵母，可分泌色氨酸(trp)，为利用营养缺陷型培养基进行筛选提供了依据。
[0030]4.本方法中PCR扩增目的片段时采取的是两种退火温度，先低温后高温，可以有效保证扩增效率和产物特异性；
[0031]5.本方法中酵母转化部分，制备酵母感受态时，设置了不同梯度浓度的菌液小体积摇菌，保证了 0D600在0.4-0.6范围，省去了从小体积培养基转到大体积培养基中摇菌扩繁的过程，简化了方法，提高了效率。
[0032]6.本方法中酵母转化部分，离心转速为4500rpm，避免了低转速离心效果不好，高转速对酵母细胞的损害。
[0033]7.本方法中酵母诱导表达时间为48h，48h是该瘤胃源全细胞木聚糖酶的最佳诱导时间。
[0034]8.本方法在荧光鉴定时选择的抗体，为Ant1-V5_FITC antibody，只需要进行一次抗体孵育，避免了一抗、二抗孵育过程的繁琐，同时也保证了荧光检测的效果。
[0035]9.本方法中木聚糖酶活性鉴定采取的是雷马氏亮蓝-木聚糖(RemazolBrilliant Blue R-D-Xy I an, RBB_xylan)法,该方法简单易行,与刚果红染色法相比,省去了染色洗脱等过程。
[0036]10.本方法所制得的干粉是通过冷冻干燥得到，保证了全细胞酶的活性。
【专利附图】

【附图说明】
[0037]图1是全细胞木聚糖酶示意图；
[0038]图2是pYDl/0RF6-UN的基因克隆策略。
[0039]图3是0RF6-UN的PCR结果，图中1、2、3为样品，4为阳性对照，5为阴性对照；
[0040]图4是pYDl/0RF6-UN的酶切结果图；
[0041]图5是pYDl/0RF6-UN的PCR鉴定结果图，图中1_6为转化子，7为阴性对照；
[0042]图6是激光共聚焦显微镜下观察细胞表面图，图中，a.EBYlOO，b.EBY100-pYDl,
c.EBY100-pYDl/0RF6-UN ；
[0043]图7是温度对全细胞木聚糖酶活性的影响；
[0044]图8是pH对全细胞木聚糖酶活性的影响；
[0045]图9是全细胞木聚糖酶的pH稳定性；
[0046]图10是全细胞木聚糖酶的热稳定性。【具体实施方式】
[0047]下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
[0048]在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0049]实施例:
[0050]一、重组质粒pYDl/0RF6-UN的构建
[0051]基因克隆策略见图2,具体步骤如下:
[0052]①设计含有BamH I和Xho I两个限制性酶切位点的引物。
[0053]上游引物(0RF6-BamHI ):
[0054]5' -TGACGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCCGC-3/ SEQ ID N0.2,
[0055]下游引物(0RF6-XhoI ):
[0056]5' -CACCTCGAGCGCCCCCTCGATATAGACCT-3' SEQ ID N0.3，
[0057]②PCR扩增木聚糖酶编码基因0RF6-UN，采用50 μ I扩增体系(3个平行)。
[0058]在PCR管中加入以下组分:
[0059]
【权利要求】
1.一种能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶，其特征在于:利用基因克隆和酵母表面展示技术将一段源自湖羊瘤胃微生物Fosmid文库的木聚糖酶编码基因0RF6-UN展示到酿酒酵母表面上，诱导表达后，离心回收细胞沉淀，经冷冻干燥后得到细胞干粉，该干粉即为瘤胃源全细胞木聚糖酶；木聚糖酶编码基因0RF6-UN的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.—种权利要求1所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤: a、重组质粒pYDl/0RF6-UN的构建， b、酿酒酵母cerevisiae)EBYlOO细胞感受态的制备、外源质粒的转化， C、酿酒酵母阳性克隆鉴定， d、重组酿酒酵母细胞EBY100-pYDl/0RF6-UN的诱导表达。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a、重组质粒pYDl/0RF6-UN的构建过程具体如下: ①PCR扩增木聚糖酶编码基因0RF6-UN； ②用限制性内切酶I和通οI双酶切目的片段和穿梭质粒pYDl ; ③构成重组质粒转化大肠杆菌iE.coli ) Trans 10感受态细胞；` ④鉴定阳性克隆，将阳性克隆单菌落接入LB培养基中扩大培养，抽提质粒pYDl/0RF6-UN。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于:步骤①中，PCR扩增采用的特异性引物为
上游引物 0RF6- BamH I:5^ -TGACGGATCCGATTTTTGTCAAACTGCCGC-3^ SEQ ID N0.2,
和下游引物0RF6- Xho I:
5 ^-CACCTCGAGCGCCCCCTCGATATAGACCT-3 ^ SEQ ID N0.3。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤d、重组酿酒酵母细胞EBY100-pYDl/0RF6-UN的诱导表达过程具体如下: ①采用添加了2%半乳糖的无氨基酸酵母氮源-酪蛋白水解物(YNB-CAA)培养基进行诱导表达； ②培养48h后离心取细胞沉淀，经冷冻干燥后得到细胞干粉，该干粉即为瘤胃源全细胞木聚糖酶。
6.一种权利要求1所述的能促进瘤胃发酵的全细胞木聚糖酶在提高反刍动物对粗饲料的利用率方面的应用，其特征在于:所述的全细胞木聚糖酶按照粗饲料重量的1.5-2.0%进行饲喂。
【文档编号】A23K1/165GK103525789SQ201310463629
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】王佳堃, 杜文, 刘建新 申请人:浙江大学