果蝇肠道免疫相关基因的筛选方法
【专利摘要】本发明涉及一种初步筛选果蝇肠道免疫相关基因的方法，本发明通过给基因突变体果蝇喂食不同种类的微生物、过氧化物、高盐离子以及具有高毒性的化学物质后，观察突变体果蝇生存率，并检测生存率较低的果蝇肠道形态变化及细胞凋亡情况，同时利用real-time?PCR方法检测突变体果蝇肠道中一些已知参与肠道免疫的信号通路的激活情况，从而能够系统、简便、快速的初步筛选出与果蝇肠道免疫相关的基因，不但有利于研究者更好的理解复杂的肠道免疫调节机制，同时也为治疗肠道疾病提供新的思路。
【专利说明】果蝇肠道免疫相关基因的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于果蝇天然免疫领域，本发明涉及一种筛选果蝇肠道免疫相关基因的方法。
【背景技术】
[0002]肠道粘膜除具有消化吸收功能外，还是内部与外部环境之间的一种屏障，能够保护宿主免受病原微生物的入侵，同时也是菌群与宿主免疫系统的调节者。当受到外界环境的不断地刺激时，肠道上皮细胞会对内部和外部因子作出应答进而确保它们自身的生存及适当的肠道内环境。近年来，越来越多的人受到肠道炎症疾病的困扰，而且长时间的炎症及组织损伤将导致肠道的癌变及肿瘤的形成。虽然人体可通过天然和获得性免疫来抵抗肿瘤，但现实条件下由于广泛的免疫逃逸机制的存在，肿瘤极少能自然消退。因此，阐明肠道上皮细胞与多种微生物之间的相互作用及共生菌群参与宿主胞内信号通路的调节机制对于肠道疾病的治疗具有重要的指导意义。
[0003]果蝇作为一个经典的实验模型已逐渐地应用于肠道免疫的研究，一些重要的影响肠道免疫的信号通路已经建立，近几年的研究热点主要集中在ROS(活性氧)及局部AMPs(抗菌肽)的产生，这两种重要的互补效应机制控制着肠道微生物的感染。在果蝇肠道中，NADPH氧化酶DUOX参与产生的ROS为抵抗微生物的入侵提供了有效的保护屏障，而MD(Immunedeficiency)信号通路诱导的局部AMPs的表达在肠道免疫中也发挥了重要的作用。同时为避免长时间过度的免疫反应，果蝇肠道会通过多种调节机制来限制IMD通路的活性及ROS的产生，这些保护机制也是维持共生菌及非病原菌生长所需要的条件。此外，肠道干细胞(ISCs)能通过增殖和分化来修复由微生物感染引起的肠道上皮细胞的损伤，而调节果蝇肠道干细胞分化的调节机制也正逐渐被阐明。已知肠道干细胞的分化受多种信号通路的调节，主要包括:Notch、Wnt、BMP (Bone Morphogenic Protein) > MAPK (Mitogen-ActivatedProtein Kinase)、JAK-STAT (Janus Kinase and Signal Transducer and Activator ofTranscription)等信号途径。有研究发现，损伤的肠细胞能分泌细胞因子Upd3,它能够激活JAK-STAT信号通路，进而促进肠道干细胞增殖及上皮细胞再生，同时发现JNK (c-JunN-terminal Kinases)途径也能对微生物感染引起的肠道损伤作出免疫应答。而Hippo信号通路能通过抑制JAK-STAT和EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor)信号通路的激活因子来负调控肠道干细胞的分化。
[0004]果蝇与人类的肠道具有相似的结构和功能，肠道干细胞的分化机制也十分相似，同时癌基因与肿瘤基因在果蝇与人类之间也是高度保守的，因此阐明果蝇肠道免疫调节机制及肠道干细胞分化机制对揭示人类肠道相关疾病的发病机制具有重要的指导作用。然而，尽管近年来果蝇模型已为肠道免 疫的研究提供了大量的信息，但一些重要的问题仍有待解决，例如，肠道上皮细胞区分共生菌群与病原菌群的机制还未被阐明，共生菌群诱导的NF-kB活性与ROS的基础性表达对宿主的意义也尚不清楚，一些重要信号通路的调控因子还未被发现。因此，本领域有必要开发一种系统且高效的筛选果蝇肠道免疫基因的方法，从而有利于研究者更好的理解复杂的肠道免疫调节机制，同时也为治疗肠道疾病提供新的思路。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种初步筛选果蝇肠道免疫相关基因的方法，该方法通过给基因突变体果妮喂食不同种类的微生物(Micrococcus Iuteus和Beauveria bassiana孢子)、过氧化物(H202)、高盐离子(NaCl)以及表面活性剂(SDS)后，观察突变体果蝇生存率，肠道的形态变化及细胞凋亡，从而能够简便、快速的初步筛选出与果蝇肠道免疫相关的基因。
[0006]本发明所采用的技术方案包括如下步骤:
[0007]( I)突变体果蝇的获得
[0008]在果蝇保种中心网站上查找并购买所感兴趣的基因突变体果蝇
[0009](2)生存率实验中喂食果蝇所需菌液及化学试剂溶液的配制方法:
[0010]I) Micrococcus Iuteus 菌菌液的配制:将保种 Micrococcus Iuteus 菌菌液按I: 100比例接种于LB液体培养基中，37°C振荡过夜培养后测其OD6tltl值，离心后收集菌体沉淀，在菌体沉淀中加入鹿糖并用去离子水定容，使Micrococcus Iuteus菌菌液终浓度达到0D6Q(I=150，蔗糖的终浓度为5%。
[0011]2)Beauveria bassiana抱子菌液的配制:将 B.bassiana bassiana 菌液涂布到 LB固体培养基上，25°C静置培养7天，用PBS溶解并收集平板上的孢子，用装有玻璃棉的注射器过滤除去孢子溶液中的残`留的LB固体培养基，测其OD6tltl值，离心后收集菌体沉淀，在菌体沉淀中加入鹿糖并用去离子水定容，使Beauveria bassiana孢子终浓度达到0D_=2,鹿糖的终浓度为5%。
[0012]3) H2O2溶液的配制:在30%的H2O2原溶液中加入蔗糖并用去离子水定容，配制成H2O2的终浓度为1%，蔗糖的终浓度为5%的混合液。
[0013](3)生存率实验中果蝇培养基的配制方法:
[0014]I)标准培养基:每200mL去离子水中加入玉米粉14.2g、琼脂1.lg、酵母粉3.3g、大豆粉1.9g、白糖17g和丙酸0.94mL。
[0015]2) SDS及NaCl培养基:在标准培养基凝固之前，按比例加入10%的SDS溶液或4MNaCl的溶液使其在培养基中的终浓度分别为0.5%及0.4M，并搅拌均匀。
[0016](4)生存率实验中微生物及化学试剂的喂食方法:
[0017]收集在标准果蝇培养基中培养并羽化3-4天的野生型及突变体果蝇，每种品系的果蝇均以30只为一组，其中雌雄各15只，将每组果蝇转移到空果蝇管中进行饥饿处理两小时，转移到配制好的SDS及NaCl培养基中，每两天换一次培养基且每天记录死亡果蝇数目；或将饥饿处理后的果蝇转移到放有5层滤纸的果蝇管中，滤纸预先加入420 μ L的预先配制好的菌液或H2O2溶液将其充分浸润，将浸润滤纸后多余的液体吸出，每24h更换一次滤纸并记录死亡果蝇数目。
[0018](5)果蝇肠道清除微生物能力的检测方法:
[0019]将Alexa Fluor488 突光素(Invitrogen, Carlsbad, CA)加入到如步骤(2)所述预先配制好的Micrococcus Iuteus菌菌液中，30°C,孵育结合30min。[0020]收集羽化3-4天的野生型及突变体雌果蝇，分别以10-15只为一组进行饥饿处理,2h后转移到放有5层滤纸的果蝇管中，滤纸预先用420 μ L AlexaFluor488 (Invitrogen, Carlsbad, CA)标记的 Μ.luteus 菌菌液充分浸润，2h 后用Axioskop2plus microscope (Zeiss)突光显微镜对部分果蚬腹部突光信号进行照相,剩余的果蝇转移到用5%蔗糖浸润5层滤纸的果蝇管中，喂食6h后用荧光显微镜对果蝇腹部荧光信号进行照相。通过荧光信号强度比较肠道对微生物的清除能力，6h后的信号越强表明没被清除的微生物越多，即肠道对微生物的清除能力就越弱。
[0021](6)检测肠道死亡细胞的免疫荧光染色方法:
[0022]取连续喂食微生物或化学试剂3-4天的果蝇，在解剖镜下对果蝇腹部进行解剖，分离出完整的肠道置于PBS中，加入7-AAD染色30min，再用40g/L的多聚甲醛固定lOmin，DAPI染色IOmin,封片后在Zeiss突光显微镜下观察并拍照。
[0023](7)肠道免疫相关信号通路激活情况的检测方法:
[0024]给果蝇喂食微生物或化学试剂，并选取不同时间点分离果蝇肠道，提取肠道RNA并反转录成cDNA，用real-time PCR方法检测肠道免疫相关信号通路靶基因的转录情况。
[0025]以下通过发明人给出的【具体实施方式】及附图来对本发明作详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为喂食B.bassiana孢子，M.1uteus及H2O2对野生型及突变体果蝇生存率的影响；
[0027]图2为突变体果蝇肠道对M.1uteus清除能力的检测；
`[0028]图3为喂食M.1uteus后，观察果蝇肠道形态变化及细胞死亡情况；
[0029]图4为喂食SDS及NaCl对野生型及突变体果蝇生存率的影响；
[0030]图5为喂食SDS对果蝇肠道形态及细胞死亡情况的影响；
[0031]图6为喂食SDS对果蝇肠道dro3及upd3基因表达的影响。
【具体实施方式】
[0032]为进一步说明本发明初步筛选果蝇肠道免疫相关基因的方法，特举以下较佳实例加以说明，应理解，本发明并不限于这些具体实例。
[0033]实施例一筛选影响果蝇肠道抗微生物感染的基因
[0034]发明人在前期的实验中筛选了 15种对真菌感染引起的天然免疫应答具有重要调节作用的基因，且这些基因在果蝇肠道免疫中的功能还尚未报道，本研究主要以这15种抗真菌感染基因为研究对象，详细基因名称及其P因子插入缺失突变体如表1所示。本实验以野生型果蝇W1118为对照组(WT)。
[0035]表1:P因子插入基因缺失突变体
[0036]
【权利要求】
1.一种筛选果蝇肠道免疫相关基因的方法，其特征在于： (1)Wflybase网站上查找感兴趣的基因，并从国内外著名的果蝇保种中心购买所要筛选的基因突变体果蝇。 (2)对突变体果蝇喂食微生物，观察突变体果蝇的生存率、肠道对微生物的清除能力，及喂食微生物后突变体果蝇肠道的形态变化、肠道细胞的凋亡情况。 (3)对突变体果蝇喂食能够引起肠道炎症及肠道应激反应的化学试剂，观察突变体果蝇的生存率、肠道的形态变化、肠道细胞的凋亡情况。 (4)喂食微生物及化学试剂后检测与果蝇肠道免疫、肠道炎症及应激反应相关的信号通路的活化情况。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于，基因突变体果蝇均购自GenExel果蝇保种中心，且均为P因子插入突变体。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述喂食的微生物为昆虫致病性真菌Beauveria bassiana 及非致病性细菌 Micrococcus Iuteus0
4.权利要求1或3所述的方法,其特征在于,喂食Beauveriabassiana的孢子浓度为OD600=2, Micrococcus Iuteus浓度为0D6(I(I=150,观察突变体果蝇的生存率。
5.权利要求1或3所述的方法，其特征在于，喂食连接AlexaFluor488荧光的Micrococcus Iuteus和Beauveria bassiana的抱子2h后喂食5%鹿糖6h,观察突变体果蝇肠道对这两种微生物的清除能力。
6.权利要求1或3所述的方法，其特征在于，喂食0D_值为150的Micrococcusluteus, 72h后观察肠道的形态变化，用7-AAD染色后，观察肠道细胞的死亡情况。
7.权利要求1所述的方法，其特征在于，所述喂食能够引起肠道炎症及肠道应激反应的化学试剂为过氧化物（H2O2)、高盐离子（NaCl)以及表面活性剂（SDS )。
8.权利要求1或7所述的方法，其特征在于，喂食H2O2的浓度为1%，SDS的浓度为O.5%，NaCl的浓度为O. 4M，观察突变体果蝇的生存率。
9.权利要求1所述的方法，其特征在于，喂食O.5%的SDS，96h后观察突变体肠道的形态变化，144h后观察肠道细胞的死亡情况。
10.权利要求1所述的方法，其特征在于，给果蝇喂食微生物或化学试剂后，选取多个不同时间点分离果蝇肠道，并用real-time PCR方法检测肠道免疫相关信号通路靶基因的转录情况。
【文档编号】A01K67/033GK103598147SQ201310479061
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年10月15日 优先权日:2013年10月15日
【发明者】金丽华, 郝阳光, 刘强 申请人:东北林业大学, 金丽华