一株抗生素溶杆菌06-4及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株抗生杆素溶菌06-4及其应用，属植物保护【技术领域】。本发明的抗生杆素溶菌06-4已经保藏。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2008年03月17日；保藏号：CGMCC?NO.2402。本发明的抗生杆素溶菌06-4在制备防治水稻白叶枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病、及烟草黑胫病生防制剂中的应用。本发明具有高效、无毒、安全无残留，06-4菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产的特点，其生产菌株抗生素溶杆菌（Lysobacter?antibioticus)06-4能够用于制备大田防治水稻白叶枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病、及烟草黑胫病的生防制剂。
【专利说明】—株抗生素溶杆菌06-4及其应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一株抗生杆素溶菌06-4及其应用，属植物保护【技术领域】。
【背景技术】:
[0002]植物细菌性病害危害大、损失重、分布较广。由稻黄单胞菌水稻变种[Xanthomonasoryzae pv.0ryzae (Ishiyama) Swings]引起的水稻白叶枯病可导致水稻重病田减产50%以上。魔芋为天南星科魔芋属的多年生草本植物，能大量提取葡甘露聚糖，是一种经济效益高的地区经济作物。由胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovora subsp.carotovora, Pcc)引起的魔芋细菌性软腐病在世界范围内发病严重，造成的损失30%_50%，严重者可达80%甚至绝收。在大田生长期和储藏期周年发生为害，感病叶片或球茎变软，从病部流出带菌汁液又侵染新的植株，使之发病，严重时引起成片倒苗。烟草是茄科一年生草本植物，是重要的经济作物。烟草青枯病(Ralstonia solanacearum)及烟草黑胚病(Phytophthora nicotianae Breda de Hean var.nicotianae)是一种分布广泛、为害严重的世界性烟草主要病害，尤其是细菌性青枯病是一种世界性的土传病害，危害番茄、辣椒、烟草、马铃薯等400余种经济作物。
[0003]针对上述细菌病害，由于大量使用防治细菌病害的化学农药，抗药菌株不断出现化学农药使用和残留严重阻碍了经济作物的出口贸易。随着我国人民生活水平的提高，蔬菜等农产品的安全质量问题收到高度关注，尤其是农药残留问题。目前对于细菌性害国内外主要采取的保守控制措施为:农业栽培措施，抗病品种等，但效果均不理想。因此，研究开发高效、无毒、安全无残留、使用简便的防治植物细菌病害的生物制剂，已经是我国农业发展中迫在眉睫的问题。
[0004]从玉米植株茎杆分离的抗生素溶杆菌06-4针对上述细菌病害在室内抑菌及田间防治方面均有良好效果。经文献检索，未见利用抗生素溶杆菌菌株应用于大田防治水稻白叶枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病、烟草黑胫病及魔芋软腐病的公开报道。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一株高效、无毒、安全无残留的抗生素溶杆菌06-4及其应用。
[0006]本发明的抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus) 06-4已经保藏。保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期:2008年03月17日；保藏号:CGMCC N0.2402
[0007]本发明的生产菌株抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)06-4,分离自云南省富源县玉米根际，经形态学、培养性状、常规生理生化、Biolog全自动鉴定系统测定和16S rDNA序列测定及其系统发育学分析，该生产菌株抗生素溶杆菌(Lysobacterantibioticus)06-4 为一个新菌株。
[0008]该菌株具有以下·特征:[0009](I)菌落圆形，有光泽，光滑，不透明稀液状，产生黑褐色色素，初期培养为暗黄色，后期培养为棕褐色，不产芽孢，有滑动现象。
[0010](2)该菌株抑菌谱广、抑菌能力强，能在十字花科蔬菜、烟草等多种作物根际定植，对红掌叶疫病菌、马铃薯青枯病菌、水稻白叶枯病菌等病原细菌都有较强的抑制作用，尤其是红掌叶疫病菌。菌株06-4对真菌也具有较好的抑制作用，对尖镰孢菌抑制效果最好，其次是烟草黑胫病菌，而对三七疫霉病菌和立枯丝核菌的抑菌效果也非常明显。
[0011](3) Biolog生菌理生化特征:L-阿拉伯糖L-arabinose、D-阿拉伯糖醇D-Arabitol> D-半乳糖 D-Galactose、a_D_ 葡萄糖 a-D-Glucose、D-甘露醇 D-Mannitol、D-山梨醇D-Sorbitol、鹿糖Sucrose、甲基丙酮酸Methlpyruvate、单甲基玻拍酸Monomethyl-Succinate、乙酸 Acetic acid、cis-乌头酸 cis-Acontic acid、梓樣酸Citric acid、甲酸 Formic acid、D-半乳糖酸内酯 D-Galactonic acid lacton、D-半乳糖醒酸 D-Galacturonic acid、D-葡糖酸 D-Gluconic acid、D-葡糖胺酸 D-Glucosaminicacid、D-葡糖醒酸 D-Glucuronic acid、a —酮戍二酸 a-Ketoglutaricacid、a —酮基戍酸a-Ketovaleric acid、丙二酸 Malonic acid、丙酸 Prpionic acid、奎尼酸 Quinic acid、D-葡糖二胺 D-sacchric acid、玻拍酸 Succinic acid、溴玻拍酸 Bromosuccinic acid、L-丙氨酸 L-Alanine、L-丙氨酰-甘氨酸 L-Alanylglycin、L-天冬酰胺 L-Asparagine、L-天冬氨酸 L-Aspartic acid、L_ 谷氨酸 L-Glutamic acid、L_ 脑氨酸 L_Proline、Y-氨基丁酸 Y-Aminobutyric acid、D-L-a-憐酸甘油 DL-a-Glycerophosphate
[0012]本发明的抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus) 06_4菌株,用于大田防治水稻白叶枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病、及烟草黑胫病。即:将保藏的06-4接种到斜面培养基上(斜面培养基配方:蛋白胨20g，甘油10ml，K2HP04l.5g,MgSO4.Η201.5g，水1000ml)放置于28± 1°C培养箱中培养3天，能用作斜面菌种；将斜面菌种接到液体培养基中制成菌悬液，在摇瓶用液体培养法 将种子放大培养至发酵罐培养，发酵培养基配方如下:1L的配方为蛋白胨 4.5g，酵母膏 1.5g，MgSO4 -H2Ol.0g，K2HPO4L Og，葡萄糖 7g，甘油 IOml，PH6.0-7.0，培养温度28±1，°C时间48h);空罐消毒和实罐消毒:空罐消毒条件为0.15Mpa，50min，实罐消毒条件为0.14Mpa，30min。灭完菌冷却后，接种发酵种子液，转速120rpm，温度28±1，V通风量24m3/h。培养54-72h，培养中12h后每个4h抽样检查一次。发酵后的发酵液加入硅藻土制成固体试剂，常温干燥2~3天；也能混入草炭制备成生物菌肥，进行使用。
[0013]本发明具有高效、无毒、安全无残留，06-4菌株活菌控病、促生效果较好，综合性状较好，易于工业化生产的特点，其生产菌株抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus) 06_4能够用于制备大田防治水稻白叶枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病及烟草黑胫病的生防制剂。
【具体实施方式】:
[0014]本发明的抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)06-4已经保藏。保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号；保藏日期:2008年03月17日；保藏号:CGMCC N0.2402
[0015]本发明的抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus) 06-4菌株,用于大田防治水稻白叶枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病及烟草黑胫病。即:将保藏的06-4接种到斜面培养基上(斜面培养基配方:蛋白胨20g，甘油10ml, K2HPO4L 5g，MgSO4.H2Ol.5g，水1000ml)放置于28± 1°C培养箱中培养3天，能用作斜面菌种；将斜面菌种接到液体培养基中制成菌悬液，在摇瓶用液体培养法将种子放大培养至发酵罐培养，发酵培养基配方如下:1L的配方为蛋白胨 4.5g，酵母膏 1.5g，MgSO4 -H2Ol.0g，K2HPO4L 0g，葡萄糖 7g，甘油 IOml，PH6.0-7.0，培养温度28±1，°C时间48h);空罐消毒和实罐消毒:空罐消毒条件为0.15Mpa，50min，实罐消毒条件为0.14Mpa，30min。灭完菌冷却后，接种发酵种子液，转速120rpm，温度28±1，V通风量24m3/h。培养54-72h，培养中12h后每个4h抽样检查一次。发酵后的发酵液能加入硅藻土制成固体试剂，常温干燥2~3天；也能混入草炭制备成生物菌肥，进行使用。
[0016]用本发明的生产菌株制备的发酵液，通过喷雾或者灌根的方式施用。已在温室和云南省楚雄州元谋县、玉溪市元江县、及玉溪市马龙县地进行了田间防效试验，证明了该菌株发酵液对水稻白叶枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病、烟草黑胫病病害的防效显著、稳定，能够有效地控制各类细菌病害及真菌病害，防治效果可达53.2-76.9%。玉溪市马龙县田间试验结果表明，生防菌06-4能有效的防治烟草黑胫病及烟草青枯病；玉溪市元江县及楚雄州元谋县田间试验结果表明生防菌06-4能稳定有效的防治水稻白叶枯病；楚雄州元谋县田间试验结果表明生防菌06-4能稳定有效的防治马铃薯青枯病；在离体试验中，菌株06-4对接种魔芋软腐病菌的带病种球腐烂防治效果也十分显著，最高可达95.4。
[0017]下面用实施例来进一步详述本发明，但本发明的内容并不局限于此。
[0018]实施例一:生防菌06-4对植物病原菌的拮抗作用测定
[0019]1.供试材料
[0020]1.1供试菌株:供试生防菌株:抗生素溶杆菌(Lysobacter antibioticus)06-4。供试植物病原菌菌株:胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium.carotovora.subsp.carotovora)强致病力菌株:MY9 ;香料烟角斑病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci):T5 ;水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.0ryzae):53、X13、Y4、Α10、Q6-39、X6、Y6、Q15-1、Q15 ;红掌叶疫病菌(Xanthomonas axonopodis pv.dieffenbachiae):XCD-S> 大白菜软腐病菌(Erwinia carotovora subsp.carotovora):Eff ;马蹄莲软腐菌(E.carotovorasubsp carotovora):WM2 ；烟草野火病菌(Pseudomonas syringaepv.tabaci) =CXltl，均由云南农业大学生物多样性与病害控制国家工程中心细菌研究室提供。马铃薯青枯病菌(Ralstonia solanacearum)Tb23由中国农业科学院植物保护研究所何礼远教授提供；三七腐霉病菌(Pythium sp.) SQ1、香荚兰根腐病菌(Fusarium orysporumSchlf.sp.Vanillae (Tucker) Gordon) Fl为云南省植物病理重点实验室真菌研究室刘云龙教授提供。水稻稻痕病病原菌(Pyricularia grisea (Cooke) Sacc.) DW、玉米大斑病病原菌(Exserohilum turcicum(pass.) Leonard&Suggs) DB、玉米小斑病病原菌(Bipolarismaydis (Nishik.&Miyabe) shoem) XB、为云南省植物病理重点实验室何月秋教授提供。烟草黑胚病病原菌(Phytophthora nicotianae Breda de Hean var.nicotianae)97007>97008由云南省玉溪烟科所方敦煌副研究员提供。
[0021]1.2供试试剂
[0022]NA培养基(蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏lg，蔗糖10g，琼脂17g，水1000mL,pH7.0) ；PDA培养基(马铃薯200g，琼脂15g，葡萄糖15g，水1000mL)。2.试验方法
[0023]菌悬液的制备:将得到的抗生素溶杆菌和病原细菌分别接入装有50ml的NA液体培养基的三角瓶中，置于28°C、160r/min摇床上培养48h。将菌悬液用无菌水适当稀释，摇均匀后，用600nm波长、Icm比色皿测定OD值。测定时用无菌NA培养基作空白对照。用无菌水稀释使得菌悬液的为OD值0.3，待用。[0024]对病原细菌抑菌作用的测定:取上步所得病原细菌菌悬液200ul加入培养皿中，将冷却至45°C左右的NA培养基倒入已加过病原细菌菌悬液的培养皿中，混匀。等完全凝固后，放置牛津杯于培养基表面，取上步所得06-4菌悬液200 μ I加入牛津杯,28°C中培养2-4d。观察、记录试验结果。
[0025]对病原真菌抑菌作用的测定:在PDA平板中心接种植物病原菌菌盘(直径5mm)，两侧2cm处接种06-4菌株。置28°C培养箱中培养，观察抑菌情况。
[0026]3试验结果
[0027]表1结果显示，生防细菌06-4为广谱生防菌，对由黄单胞属细菌引起的水稻白叶枯病、细菌性条斑病、红掌叶疫病，由欧文氏菌属细菌的魔芋软腐病、大白菜软腐病，有较好防治作用；对水稻稻瘟病、芦荟根腐病、香荚兰根腐病、烟草黑胫病，真菌病害均有防治作用，对土传病害的控制具有较大的应用潜力。其中，防治效果最好的病害包括:水稻白叶枯病、马铃薯青枯病、烟草青枯病、烟草黑胫病病害。
[0028]表1生防菌06-4菌株对植物病原细菌的抑菌效果
[0029]
【权利要求】
1.一株抗生杆素溶菌06-4，其保藏号为:CGMCC N0.2402。
2.权利要求1所述的抗生杆素溶菌06-4在制备防治水稻白叶枯病，马铃薯青枯病、烟草青枯病及烟草黑胫病生防制剂中的应用。
【文档编号】A01P1/00GK103667129SQ201310651899
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月6日 优先权日:2013年12月6日
【发明者】姬广海, 周丽洪, 魏兰芳, 肖炳光 申请人:云南农业大学