可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用的制作方法

可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用，其中制备方法包括：将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中；以及培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系，所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系即为可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，其中，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP中携带的mbp基因启动子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。利用该方法能够有效制备获得可特异性清除髓鞘组织、引起髓鞘脱失且能够稳定遗传的转基因斑马鱼，并且在甲硝唑的作用下，该转基因斑马鱼幼鱼的少突胶质细胞可以被特异性清除，使其出现髓鞘脱失的病理改变，并伴有运动功能下降，进而，该转基因斑马鱼能够为活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制，以及相关药物筛选提供有力的动物模型。
【专利说明】可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及斑马鱼模型的制备方法与应用，具体地，涉及可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其制备方法和应用。更具体地，本发明涉及制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法、可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼及其在髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或再生机制研究，以及筛选用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]髓鞘是保护、支持和营养轴突的膜性结构，在中枢神经系统，髓鞘由成熟的少突胶质细胞伸出突起包绕轴突形成；而在外周神经系统则由施万细胞构成。髓鞘的主要功能是起绝缘作用，介导神经冲动的正常、快速传递，是神经系统发挥功能的结构基础。在人类，当髓鞘在遗传因素和/或外在环境因素作用下受到损伤，即引起以多发性硬化为主要表现的脱髓鞘疾病，除髓鞘脱失外，还出现 神经轴突退化，患者出现不同程度的感觉、运动和识别等功能丧失。
[0003]截至目前，髓鞘脱失的机制不明，利用动物模型深入研究髓鞘的损伤与再生是一个有效途径。然而，目前用于髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或髓鞘再生机制和相关药物筛选研究的动物模型，仍有待改进。

【发明内容】

[0004]需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
[0005]斑马鱼发育快速、胚胎透明，髓鞘结构特征、形成过程及基因表达方式与哺乳动物高度相似，是研究髓鞘损伤与再生的理想动物模型。然而，目前还未见关于髓鞘损伤或髓鞘脱失的斑马鱼模型的报道，利用转基因技术建立髓鞘损伤或髓鞘脱失的斑马鱼模型是活体研究髓鞘损伤和再生机制的新途径。
[0006]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种能够有效制备可特异性清除髓鞘组织、获得髓鞘脱失的转基因斑马鱼模型的方法。
[0007]进而，发明人做了大量工作，最终发现将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼，髓鞘碱性蛋白基因启动子驱动绿色荧光蛋白，能够成功构建可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼Tg (mbp:nfsB::EGFP)0进而，在甲硝唑的作用下，可以特异性清除幼鱼的少突胶质细胞，使其出现髓鞘脱失的病理改变，并伴有运动功能下降。该转基因斑马鱼Tg (mbp:nfsB::EGFP)将为深入活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制提供有力的动物模型。
[0008]根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法。根据本发明的实施例，该方法包括如下步骤:将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中；以及培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系，所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系即为可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，其中，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP中携带的mbp基因启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]具体地，所述mbp基因(即髓鞘碱性蛋白基因)启动子的核苷酸序列如下所示:
[0010]ataataacaa tcccaactcc atgttgcaga tgctgagatg tgactactgc aaatgaacac 60
[0011]ggtgtgatat tgatgccgaa acaatatatt gtgcagccct acaataaacc ttggattaaa 120
[0012]gtgcatattg acggtcctat gaatttactt tagatgatta catttcaaat ggaatgacag 180 [0013]aaatatttca gattttgtta caaataatga ataataaata taaattaata aactcaatgt 240
[0014]ctgattagta ctttgcactg ctacagtaat acttaatttg ttcagattta aaggtgattt 300
[0015]ttcaatattt agattttttt aaaccctcca tgttttcaaa tatttgtcca tgctaacaac 360
[0016]ccatgcaatg gaaatcattg attagatgga aatccatcta atcaatggat tatgtataaa 420
[0017]gaaataaggt ggtttagtat tggggtgaat taaacattta tcgtcatttt tatcacagtt 480
[0018]atactaacat atacttactc ccatgaccat ttaataaaaa tattatctta taatgatgaa 540
[0019]taaacaagca ttctttaaac tccactgtaa aaaaactcac aaagctaaag ttatttacat 600
[0020]ttaaacacgt tttacatctt tcagcacatc ctagtttaga tttcctattt gaaatcacat 660
[0021]gccatcattt tttaaatcgc tgcgtgtcta tatttgattg tatatgacat tgactggatg 720
[0022]tgtttacaaa ctcatcattt ctgcctttta tttcctgaac tatttcacat gcatgcctca 780
[0023]ttattttagc ctatgcatgt ttacccagtt gtctggattt ctagcttgaa tgaatttcct 840
[0024]cttctaatga cctcgtggca aacatcttaa ggacaaagaa aattgcagct gcacatctgg 900
[0025]ccgaacacag caaaggtaaa cctttattta tatgatcaaa aatgtcagtt ttgtgacatt 960
[0026]tcagtgcagg aacaacaaca aaaagagaca ttttttgaaa aaagtgaatg aataaataat 1020
[0027]aaaagcagaa tgttttacta tggaacactg tggcctttgt ttgctggcca tacttgcatc 1080
[0028]acaaacaact gtcaattgtt tgacaaaagg cagcaaaaaa cagcacacta aagccaacaa 1140
[0029]cgtttttacc ctcgacagag acagatttgt ccatgtgttc ataacgtttt ctctgaaaag 1200
[0030]aaccatgctg agtatcacac acagcagttg gttaatgaat tgcaaagtca ctggaaatta 1260
[0031]atttgcagat atttcaagac ttggagcgaa cagagcaagc ggggcgaatg cagattgcaa 1320
[0032]cgtttatctg ggatacaaat tacagcacct acttcaagaa atcaatccaa gaactcgttc 1380
[0033]ggcatctcaa ggccaaaatt tatcaatgaa ataaacaaag gcgtgtagcg taacatcatc 1440
[0034]aacgtctcga tcatcttgcg tgatgaatga aacatggagt ggtttgtctg cagatgacaa 1500
[0035]tttcaaactc ttacatgttt gcaatgcacc atatgtgatc cctcaacgta aactatttgt 1560
[0036]ataatgaaca tgagtcacca caacaatggt ttgattgtgc caaagccgtt cttcgatgtg 1620
[0037]ctctgcttct ttctcataga caggccttgt tgttctgggc tcaagtcggg gcagatgtgg 1680
[0038]actagaacaa tagcagctcc ttttatcaga gagcagggta gtgacaccct ccgcgggcac 1740
[0039]acagggctcg aaagaatgcc tggcaccagc ccagtatcac tgacgctatt gcaggcccac 1800
[0040]ctcatctcct gtgatgccat gcaacggagg ggacgacacc ttcaaaggcc agcccttcgt 1860
[0041]gcttagaagc gccgaagact atcgagaagg tttgcagaan sdarcgtctc cagagcggac 1920
[0042]tttggattga gcggagaagg acatac(SEQ ID N0.1)1946
[0043]发明人惊奇地发现，利用本发明的方法，能够有效制备获得可特异性清除髓鞘组织、引起髓鞘脱失的转基因斑马鱼Tg(mbp:nfSB::EGFP)。此外，根据本发明的实施例，上述制备获得的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，在甲硝唑的作用下，幼鱼的少突胶质细胞可以被特异性清除，使其出现髓鞘脱失的病理改变，并伴有运动功能下降，进而，该转基因斑马鱼Tg (mbp:nfsB::EGFP)能够为活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制，以及相关药物筛选提供有力的动物模型。
[0044]另外，根据本发明上述实施例的制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法还可以具有如下附加的技术特征:
[0045]根据本发明的实施例，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP是通过如下步骤构建获得的:通过BamHI和NcoI酶切、T4连接酶连接，将SEQ ID N0.1所示的mbp基因启动子克隆到已知质粒pgrna-nfsB-EGFP中。
[0046]根据本发明的实施例，进一步包括:从pCS2FA-转座酶通过mMESSAGE mMACHINE系统制备Tol2转座酶mRNA。
[0047]根据本发明的实施例，将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中，包括:将2μ l、25ng/y I的重组质粒mbp-nfsB-EGFP和2μ l、35ng/y I的Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼胚胎中。由此，能够有效提高转基因效率，以及H)阳性个体的比率。
[0048]根据本发明的实施例，通过以下步骤培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系:利用荧光显微镜对经过转化的斑马鱼进行筛选，以便确定H)阳性个体，其中，所述经过转化的斑马鱼中在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体即为H)阳性个体；常规养殖所述H)阳性个体至具备繁殖能力，并将具备繁殖能力的H)阳性个体与野生型斑马鱼进行交配，以便 获得Fl代斑马鱼；利用荧光显微镜对所述Fl代斑马鱼进行筛选，以便确定Fl阳性个体，其中，所述Fl代斑马鱼中在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体即为Fl阳性个体；将所述Fl阳性个体与野生型斑马鱼个体进行交配，以便得到稳定遗传的转基因斑马鱼品系。
[0049]具体地，根据本发明的另一些实施例，本发明的制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法，还可以包括以下步骤:
[0050](I)克隆mbp基因启动子，制备重组质粒mbp-nfsB-EGFP，通过PCR方法扩增斑马鱼髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,mbp)基因启动子,其长度为1.9kb,包含第一个外显子，序列为SEQ ID N0.1，扩增引物序列为SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5，用BamH1、NcoI和T4连接酶将mbp启动子替换到pgrna-nfsB-EGFP质粒上；
[0051](2)制备Tol2转座酶mRNA，从pCS2FA_转座酶通过mMESSAGE mMACHINE系统制备To12转座酶mRNA ；
[0052](3)胚胎转化与筛选，将2μ I质粒mbp-nfsB-EGFP和2μ I Το12转座酶mRNA在I~4细胞期共注射到野生型(AB系)斑马鱼胚胎中。具体步骤如下:配制10 μ I工作液，包括mbp-nfsB-EGFP2 μ 1，Το12 转座酶mRNA2 μ I，酚红(Phenol Red)2.5μ l，DEP(^jC3.5y I。表达载体mbp-nfsB-EGFP和To 12转座酶mRNA工作浓度分别为25ng/ μ I和35ng/ μ I。其中，酚红仅用于指示颜色，以确定是否注射成功。将工作液放入显微注射针内(由玻璃毛细管拉制而成)，利用显微注射仪，在I~4细胞期将工作液注射到野生型(AB系)斑马鱼胚胎中，注射的位置在卵黄囊内靠近细胞极处，注射体积为Iml/胚胎。在96hpf，利用荧光显微镜筛选H)，沿脊柱两侧分布有串珠样绿色荧光蛋白阳性信号分布的个体被认定为H)阳性个体。常规养殖H)阳性个体至具备繁殖能力，与野生型(AB系)交配，以便获得Fl代斑马鱼，然后用同样方法筛选Fl代斑马鱼，以确定Fl阳性个体，。Fl阳性个体再与野生型(AB系)个体交配，以便得到稳定遗传的转基因斑马鱼品系Tg(mbp:nfsb::EGFP)。
[0053] 根据本发明的一些实施例，进一步包括:利用原位杂交技术对所述H)阳性个体和所述Fl阳性个体进行假阳性检测。由此，能够避免发育过程中的色素沉着产生假阳性荧光信号影响最终结果。根据本发明的另一些实施例，利用原位杂交技术对所述H)阳性个体和所述Fl阳性个体进行假阳性检测进一步包括:在E3孵化液中加入0.003%的1-苯基-2-硫脲(l-phenyl-2-thiourea,PTU,Sigma)至6dpf (授精的天数)，收集幼鱼，以4%多聚甲醒固定，以mbp mRNA标记少突胶质谱系细胞，然后，按照原位杂交标准化流程进行幼鱼整体原位杂交，确定阳性转基因个体。其中，阳性信号的定位与GFP阳性信号一致时，表明GFP标记的细胞为少突胶质细胞谱系细胞，即阳性转基因个体。
[0054]根据本发明的实施例，进一步包括:使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，以便获得少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼。
[0055]其中，根据本发明的一些具体示例，使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，进一步包括:利用细胞培养板培养所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMS0-E3孵化液，于28.5°C下避光培养5天，以便获得经过处理的转基因斑马鱼品系；将所述经过处理的转基因斑马鱼品系以DMS0-E3孵化液清洗3次、每次5min，其中，所述甲硝唑DMS0-E3孵化液的配制方法为将甲硝唑溶于所述DMS0-E3孵化液，所述甲硝唑的工作浓度是5mM，所述DMS0-E3孵化液为添加了 0.2体积％DMS0的E3孵化液。其中，本发明所采用的与斑马鱼养殖等相关表达方式例如“E3孵化液”等均为本领域常规术语，其具体含义或组成等可参见下文提供的标准化方案:WeSterfield，M.Thezebrafish book:a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydaniorerio) 1993, Eugene, 0R:M.Westerfield,通过参照将其全文并入本文。例如，本发明所述的的E3孵化液为60 μ g/ml海盐。
[0056]根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼。根据本发明的实施例，该可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼是通过前面所述的方法制备获得的。
[0057]发明人发现，该可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，在甲硝唑的作用下，幼鱼的少突胶质细胞可以被特异性清除，从而出现髓鞘脱失的病理改变。进而，发明人又对上述出现髓鞘脱失病理改变的转基因斑马鱼进行了行为学评价:于IOdpf (受精的天数)时期收集清洗后的甲硝唑处理组和对照组(未经甲硝唑处理的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼)幼鱼,放入含Iml/孔E3孵化液的48孔板(每孔一条幼鱼)，每次每组八条，重复三次；开始实验前幼鱼首先适应环境15min，再让幼鱼在孔板中自由运动，以孔板上方架设的摄像机记录视频IOmin,以Ethovision XT软件分析视频,绘出运动轨迹图，并通过总运动距离、平均运动速度两个指标进行定量统计分析。结果发现，甲硝唑处理组的总运动距离和平均运动速度显著低于对照组，即与对照组相比，髓鞘损伤造成斑马鱼运动能力下降。进一步验证了斑马鱼髓鞘损伤造成斑马鱼运动能力下降。
[0058]换言之，发明人发现，本发明的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，能够稳定遗传，不仅能够特异性地标记髓鞘组织，还能在甲硝唑的作用下特异性造成髓鞘的损伤，并伴有运动能力下降，其在一定程度上能够模拟人类髓鞘脱失的病理改变和功能变化，进而，该转基因斑马鱼能够用作活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制，以及相关药物筛选的动物模型。
[0059]这是因为，Mbp基因特异性表达在少突胶质细胞谱系细胞，即中枢神经系统的少突胶质细胞和周围神经系统的施旺氏细胞，本发明的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼(即Tg (mbpmfsB::EGFP))转基因斑马鱼以绿色荧光蛋白(EGFP)驱动mbp启动子，同时携带了 nfsB细胞毒性基因(其编码硝基还原酶(Nitroreductase，NTR)),因此这个模型具有两个优势:第一，通过上述方法制备得到的该转基因斑马鱼可以稳定遗传，由于斑马鱼个体小，产卵量大，因此容易获得大量遗传背景和表型一致的实验动物个体，这就为筛选新的药物或治疗方法打下了坚实的基础；第二，髓鞘细胞不仅被绿色荧光蛋白特异性标记，而且可以经甲硝唑的处理被特异性、可逆性、可控性清除，不仅适合于有关髓鞘形成的研究，还可以诱导髓鞘细胞的损伤进而恢复，从而深入研究髓鞘损伤和再生的机制。
[0060]由此，根据本发明的又一方面，本发明还提供了前面所述的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼在髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或再生机制研究，以及筛选用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物中的应用。即该可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，在甲硝唑的作用下，幼鱼的少突胶质细胞可以被特异性清除，使其出现髓鞘脱失的病理改变，并伴有运动功能下降，进而，该转基因斑马鱼能够用作活体研究髓鞘损伤与再生的调控机制，以及相关药物筛选的动物模型。
[0061]根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种筛选用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括:根据权利要求前面所述的方法，制备获 得可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼；使用甲硝唑对所述可特异性清除髓鞘组织的转基 因斑马鱼进行处理，以便获得少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼；以及在存在所述药物的条件下，对所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼进行培养，并基于培养前后所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼的运动能力的变化情况对所述药物进行筛选，其中，所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼培养后相对于培养前运动能力提高，为所述药物能够用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的指示。由此，利用该方法能够有效地筛选治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物。其中，需要说明的是，可以以总运动距离和平均运动速度作为指标衡量斑马鱼的运动能力。
[0062]其中，根据本发明的实施例，使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，进一步包括:利用细胞培养板培养所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMS0-E3孵化液，于28.5°C下避光培养5天，以便获得经过处理的转基因斑马鱼品系；将所述经过处理的转基因斑马鱼品系以DMS0-E3孵化液清洗3次、每次5min，其中，所述甲硝唑DMS0-E3孵化液的配制方法为将甲硝唑溶于所述DMS0-E3孵化液，所述甲硝唑的工作浓度是5mM，所述DMS0-E3孵化液为添加了 0.2体积％DMS0的E3孵化液。
[0063]此外，需要说明的是，本发明将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA经显微注射至斑马鱼胚胎中，筛选并鉴定得到能够稳定遗传的转基因斑马鱼后，该转基因斑马鱼中的待清除细胞被荧光蛋白特异性标记，并携带NTR，进而将转基因斑马鱼暴露在一定浓度的甲硝唑(metronidazole,Mtz)中，因Mtz仅对NTR表达阳性产生细胞毒性作用，而导致该种细胞的特异性清除。本发明的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼作为动物模型的有点在于:1.甲硝唑容易通过水进入斑马鱼体内，在5dpf以后的斑马鱼中即可应用，通常使用浓度为l_5mM，即使在IOmM下对成体鱼的存活和正常生活没有明显影响];2.清除作用快速，在甲硝唑作用后12-72小时实现细胞清除，通过荧光蛋白观察或免疫组化等方法容易观察清除效果；3.清除过程可逆，脱离甲硝唑后，24小时后细胞开始复原，但不同细胞复原时间各异。从而，本发明的转基因斑马鱼能够被精准地特异性清除少突胶质细胞和/或施旺氏细胞，从而引起髓鞘组织特异性缺失，进而能够有效用作髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或再生相关研究的动物模型。
[0064]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】

【附图说明】
[0065]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0066]图1显示了根据本发明一个实施例的mbp-nfsB-EGFP重组质粒的示意图；
[0067]图2显示了根据本发明一个实施例，转基因后斑马鱼脊椎周围表达绿色荧光蛋白的情况；
[0068]图3显示了根据本发明一个实施例，利用mbp原位杂交检测荧光蛋白的表达部位结果图； [0069]图4显示了根据本发明一个实施例，甲硝唑处理前后对少突胶质细胞的影响的检测结果图；以及
[0070]图5显示了根据本发明一个实施例，表示髓鞘损伤对斑马鱼运动能力的影响的检测结果图。
[0071]需要说明的是，本发明所述的重组质粒mbp-nfsB-EGFP的结构均如图1所示。【具体实施方式】
[0072]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0073]实施例1
[0074]一、实验材料和方法
[0075]1、实验动物
[0076]按标准化方案(可参照:Westerfield,M.The zebraf ish book: a guide for thelaboratory use of zebrafish(Brachydanio rerio) 1993, Eugene, 0R:M.ffesterfield,通过参照将其全文并入本文)养殖野生型斑马鱼(AB品系)，水温28.5°C，光照/黑暗周期为14h/10h，成体斑马鱼产卵后收集胚胎，养殖于E3孵化液，以受精的小时数(hourspost-fertilization, hpf )或受精的天数(days post-fertilization, dpf )表不胚胎和幼鱼的发育阶段。
[0077]2、转基因斑马鱼的制备[0078]通过Tol2系统制备转基因斑马鱼Tg (mbp:nfsB::EGFP)。
[0079]2.1 构建 mbp-nfsB-EGFP 重组质粒
[0080]通过PCR方法扩增斑马鱼髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein, mbp)基因启动子，一个启动子长度为1.9kb，序列见SEQ ID N0.1，包含第一个外显子，其引物序列为:正向引物:5’ -CGCCGGGATCCATAATAACAATCCCAACTC-3’ (SEQ ID N0.4)，反向引物:5’-CG CCGCCATGGGTATGTCCTTCTCCGCTCA-3’ (SEQ ID N0.5);另一个启动子长度为 2.2kb，序列见SEQ ID N0.2，包含第一个外显子，其引物序列为:正向引物:5’ -CGCCGGGATCCTGCTGAGATGTGACTACTG-3’(SEQ ID N0.6),反向引物:5’ -CGCCGCCATGGGCTCTGTGCCTATAAACTGC-3’ (SEQ ID N0.7);第三个启动子长度为 1.9kb，序列见 SEQ ID N0.3,不包含第一个外显子，其引物序列为:正向引物:5’ -CGCCGGGATCCCGATCCGTCTACGACTCTA-3’ (SEQ ID N0.8)，反向引物:5，-CGCCGCCATGGCCATGGGGTGTTGATCTGT-3，(S EQ IDN0.9)。
[0081]PCR反应条件为:
【权利要求】
1.一种制备可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼的方法，其特征在于，包括如下步骤:将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中；以及培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系，所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系即为可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，其中，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP中携带的mbp基因启动子的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒mbp-nfsB-EGFP是通过如下步骤构建获得的:通过BamHI和NcoI酶切、T4连接酶连接，将SEQ ID N0.1所示的mbp基因启动子克隆到已知质粒pgrna-nfsB-EGFP中。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括:从PCS2FA-转座酶通过mMESSAGE mMACHINE 系统制备 Tol2 转座酶 mRNA。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将重组质粒mbp-nfsB-EGFP与Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼中，包括:将2μ l、25ng/y I的重组质粒mbp-nfsB-EGFP和2μ l、35ng/y I的Tol2转座酶mRNA共同导入野生型斑马鱼胚胎中。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下步骤培养获得稳定遗传的转基因斑马鱼品系:利用荧光显微镜对经过转化的斑马鱼进行筛选，以便确定H)阳性个体，其中，所述经过转化的斑马鱼中在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体即为H)阳性个体；常规养殖所述H)阳性个体至具备繁殖能力，并将具备繁殖能力的H)阳性个体与野生型斑马鱼进行交配，以便获得Fl代斑马鱼；利用荧光显微镜对所述Fl代斑马鱼进行筛选，以便确定Fl阳性个体，其中，所述Fl代斑马鱼中在脊髓两侧有呈线状分布、表达绿色荧光蛋白细胞的个体即为Fl阳性个体；将所述Fl阳性个体与野生型斑马鱼个体进行交配，以便得到稳定遗传的转基因斑马鱼品系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括:利用原位杂交技术对所述H)阳性个体和所述Fl阳性个体进行假阳性检测。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括:使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，以便获得少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，进一步包括:利用细胞培养板培养所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMS0-E3孵化液，于28.5°C下避光培养5天，以便获得经过处理的转基因斑马鱼品系；将所述经过处理的转基因斑马鱼品系以DMS0-E3孵化液清洗3次、每次5min，其中，所述甲硝唑DMS0-E3孵化液的配制方法为将甲硝唑溶于所述DMS0-E3孵化液，所述甲硝唑的工作浓度是5mM，所述DMS0-E3孵化液为添加了 0.2体积％DMS0的E3孵化液。
9.一种可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼，其是通过权利要求1-8任一项所述的方法制备获得的。
10.权利要求9所述的可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼在髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或再生机制研究，以及筛选用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物中的应用。
11.一种筛选用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的药物的方法，其特征在于，包括:根据权利要求1-6任一项所述的方法，制备获得可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼；使用甲硝唑对所述可特异性清除髓鞘组织的转基因斑马鱼进行处理，以便获得少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼；以及在存在所述药物的条件下，对所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼进行培养，并基于培养前后所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼的运动能力的变化情况对所述药物进行筛选，其中，所述少突胶质细胞和/或施旺氏细胞被特异性清除的转基因斑马鱼培养后相对于培养前运动能力提高，为所述药物能够用于治疗髓鞘脱失、髓鞘损伤和/或用于髓鞘再生的指示。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，使用甲硝唑对所述稳定遗传的转基因斑马鱼品系进行处理，进一步包括:利用细胞培养板培养所 述稳定遗传的转基因斑马鱼品系，其中每孔加入5ml5mM甲硝唑DMSO-E3孵化液，于28.5°C下避光培养5天，以便获得经过处理的转基因斑马鱼品系；将所述经过处理的转基因斑马鱼品系以DMSO-E3孵化液清洗3次、每次5min，其中，所述甲硝唑DMSO-E3孵化液的配制方法为将甲硝唑溶于所述DMSO-E3孵化液，所述甲硝唑的工作浓度是5mM，所述DMSO-E3孵化液为添加了 0.2体积％DMSO的E3孵化液。
【文档编号】A01K67/027GK103966261SQ201410109257
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年3月21日 优先权日:2014年3月21日
【发明者】魏世辉, 李玉皓, 方杨武 申请人:中国人民解放军总医院, 南开大学