培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因斑马鱼的方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因斑马鱼的方法、由该方法得到的转基因鱼的应用及其专用质粒。本发明提供一种培育转基因斑马鱼的方法，包括以下步骤：(1)构建lingo-1重组表达载体，所述lingo-1重组表达载体包含适当的核酸内切酶酶切位点、斑马鱼lingo-1基因启动子序列、荧光蛋白编码框和poly?A片段；(2)用步骤(1)中的重组表达载体转化斑马鱼受精卵，得到F0代；和(3)将F0代与野生型的斑马鱼杂交，得到lingo-1特异性基因标记的转基因斑马鱼。本发明还鉴定了斑马鱼lingo-1基因启动子，其核苷酸序列为SEQ?ID?No：1。
【专利说明】培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因斑马鱼的方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因鱼的方法及由该方法得到的转基因鱼的应用，本发明还涉及一种用于培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因鱼的专用质粒。具体而言，本发明涉及一种培育Iing0-1转基因斑马鱼的方法及由该方法得到的Iingo-1转基因斑马鱼的应用，以及用于培育Iingo-1转基因斑马鱼的专用质粒。本发明还鉴定了斑马鱼Iingo-1基因启动子，其核苷酸序列为SEQ ID No:1。
【背景技术】
[0002]髓鞘化(myelination)即神经胶质细胞辨识并附着到轴突合适位置而形成多层紧密包裹的髓鞘的过程(Simons，2006 ;Franklin et al.，2008)。目前对许多脊椎动物的髓鞘化过程有广泛的研究。髓鞘功能是增加神经冲动的传导速度并维持与轴突的完整性，如果发生损伤或缺陷会导致诸如多发性硬化(multiple sclerosis,MS),视神经炎等病症。由髓鞘形成不正常所导致的疾病可分为两大类:髓鞘缺失或脱髓鞘(demyelination)和髓鞘形成障碍(dysmyelination)。常见的中枢神经系统脱髓鞘疾病为多发性硬化症，是一种自身免疫性疾病(autoimmune disease)，中枢的髓鞘和少突胶质细胞受到由T细胞介导的免疫攻击(Trapp，1999)。该疾病的一个重要特征是由中枢神经系统中发生的炎症反应和胶质增生(gliosis)所导致的髓鞘丢失(Fawcett & Asher, 1999 ；Logan & Berry, 2002)。对这种髓鞘病变的起因有许多假说解释(Franklin，2002，2008)，但至今仍是个迷。
[0003]目前已知有许多因子参与调控CNS的轴突和髓鞘再生，如促进神经生长的神经生长因子(Nerve Growth Factor, NGF)、脑衍生神经营养因子(Brain derived NeurotrophicFactor, BDNF)等神经营养`素(Neurotrophins, NT),以及一些抑制神经再生的因子如髓鞘相关糖蛋白(Myelin-associated glycoprotein, MAG)、少突胶质细胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocyte myelin glycoprotein,OMgp)、髓鞘喊性蛋白(Myelin basic protein,MBP)和近年来被发现并大量研究的神经抑制蛋白(Nogo)等(Filbin,2003 ；Grados-Munro& Fournier,2003)。
[0004]针对MS的基础性研究中最有代表性使用的动物模型是实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)(Trapp, 1999 ；Franklin et al.,
2008)。人们已在小鼠、大鼠有限的中枢神经系统损伤后髓鞘修复的模型(如EAE)上了解许多髓鞘丢失、少突胶质细胞分化和成熟调控及再髓鞘的细胞分子机制(Bruce et al.，
2009)。尽管如此，少突胶质细胞及髓鞘相关抑制因子在一个中枢神经系统损伤后本身就能很好再生的模式动物斑马鱼上的研究则起步较晚。成年斑马鱼中枢神经系统具有高度分化和完整的髓鞘，基因和蛋白组学数据显示其存在髓鞘相关抑制因子和类似于哺乳类少突胶质细胞调控因子，它是一个非常适宜开展中枢神经系统损伤后髓鞘修复过程分子机理研究的模式动物。特别地，成年斑马鱼视神经损伤后再生过程中再髓鞘机理未有报道，且髓鞘相关抑制因子除Nogo新近工作外(Abdesselem et al., 2009),其它少有研究。[0005]近期，Mi等人发现并鉴定了一种神经系统特异性跨膜蛋白LING0-1是少突胶质细胞分化成熟的负调控因子(Mi et al.，2004 ；2005)，我们及合作者在EAE动物模型上研究结果提示LING0-1的拮抗剂或针对其信号通路上的分子调控物是富有前景的CNS脱髓鞘疾病治疗的候选药物(Mi and Hu et al.，2007)。
[0006]然而，Mi等前人的LING0-1研究都是在小鼠或大鼠上进行的，建立的是Iingo-1基因敲除(knockout)的小鼠模型，着重研究该基因的表达和功能。进一步地，当时的研究工作针对的是拮抗该Iingo-1受体蛋白质的药物开发。这些与本发明人在本申请中构建的特异性标记少突胶质细胞可视化的斑马鱼模型是有本质上的差别的。本发明是借助转基因操作构建在斑马鱼上特异性标记少突胶质细胞，使之成为一种特定的工具，有可能应用于筛选对少突胶质细胞影响的小分子或药物。如同以下罗列的几种已经申请专利或已被授权的转基因斑马鱼品系。
[0007]目前几种少突胶质细胞特异性基因标记的转基因鱼品系如:Tg(0lig2:egfp)(Shin J.& Park HC, Appel et al.2003) ； Tg (pip: egfp) (Yoshida M & Macklin 2005)；Tg(nkx2.2a:megfp)(Kirby B.B.& Takada N，Appel et al.2006) ；Tg(mbp:egfp)(Park &Kim et al.2009) ；Tg (claudin k: gfp) (Munzel et al.2011);上述转基因鱼品系多为标记少突胶质细胞前体细胞(OPC)、pMN以及分化中或未成熟的少突胶质细胞。而本发明中的Iingo-1基因调控序列具备启动子性质，整合荧光蛋白编码框(如EGFP)后，可特异性的标记后期成熟的和包裹形成髓鞘的少突胶质细胞，为在位活体动态观察少突胶质细胞行为和髓鞘再生过程提供了有力的工具。
[0008]转基因技术(Transgene technology)是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。斑马鱼是一种理想的用于转基因研究的新型模式动物，近年来发展起来的转座酶Tol2或核酸内切酶1-SceI介导的转基因方法可促使转移基因与宿主基因组更早的融合，极大的提高了斑马鱼转基因瞬时表达和稳定性表达的效率。转座酶Tol2可介导多位点的单拷贝基因与宿主基因组的整合，而核酸内切酶1-SceI则可介导低拷贝的单一位点整合。
[0009]与内源基因的表达类似，外源基因在受体动物中表达需要的转基因构件包括启动子及相关调节序列、目的基因和终止信号3个基本结构。外源基因的表达会受到构建于表达载体中的启动子的调控，由于启动子的驱动强度受多个调控因子的影响，使用异源启动子可能会导致外源基因表达量低下。转录终止子是转基因构件中的另一个元件。商品化的转基因表达载体常使用SV40 poly A终止信号序列，例如表达载体pEGFP-1 (Clontech)。
【发明内容】
[0010]本发明涉及一种培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因鱼的方法及由该方法得到的转基因鱼的应用，本发明还涉及一种用于培育标记中枢神经系统少突胶质细胞的转基因鱼的专用质粒。具体而言，本发明涉及一种培育Iing0-1转基因斑马鱼的方法及由该方法得到的Iingo-1转基因斑马鱼的应用，以及用于培育Iingo-1转基因斑马鱼的专用质粒。本发明还鉴定了斑马鱼Iingo-1基因启动子，其核苷酸序列为SEQ ID No:1。
[0011]本发明提供一种培育Iingo-1转基因斑马鱼的方法，其包括以下步骤:
[0012](I)构建Iingo-1重组表达载体,所述Iingo-1重组表达载体包含适当的核酸内切酶酶切位点，斑马鱼Iingo-1基因启动子序列，荧光蛋白编码框和poly A片段；
[0013](2)用步骤⑴中的重组表达载体转化斑马鱼受精卵，得到代；和
[0014](3)将R)代与野生型斑马鱼杂交，得到Iingo-1特异性基因标记的转基因斑马鱼。
[0015]其中，步骤(3)中得到的转基因斑马鱼可以进一步通过传统的育种方法得到转基因斑马鱼的纯合体。
[0016]其中所述步骤(1)中所用的核酸内切酶酶切位点为，例如，1-SceI限制酶酶切位点或Tol2转座酶酶切位点，优选1-SceI限制酶酶切位点；所述荧光蛋白选自EGFP、mCherry、RFP、YFP 或 DsRED ;所述 poly A 片段选自 SV40poly A 片段或 BGH poly A 片段。本领域技术人员可以根据实际需要选择适当的荧光蛋白和poly A片段。
[0017]其中所述步骤(1)中构建的Iingo-1重组表达载体即为本发明所述的用于培育Iingo-1转基因斑马鱼的专用质粒。在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤
(I)中，将斑马鱼Iingo-1基因启动子序列、荧光蛋白编码框和poly A片段插入到载体p1-Scel-pBSI1-SK+中，得到所述Iingo-1重组表达载体，该重组表达载体即为本发明所述的用于培育Iingo-1转基因斑马鱼的优选的专用质粒。
[0018]利用本发明的上述方法，构建得到lingo-1:荧光蛋白转基因品系斑马鱼。在本发明的优选实施方案中，构建得到lingo-l:EGFP转基因品系斑马鱼。但是，本领域技术人员应该理解，所述突光蛋白除EGFP之外,也可以应用其他合适的标记蛋白，例如，mCherry、RFP、YFP或DsRED等。本领域技术人员可以根据实际需要进行适当的选择。
[0019]斑马鱼Iingo-1基因启动子序列(核苷酸序列见SEQ ID No:1)通过生物信息学对斑马鱼Iingo-1基因组序列(Genbank:BX470207)预测并设计引物进行基因组PCR获得。并且，本发明人通过实验验证了所预测的核苷酸序列(SEQ ID No: I)具有启动子功能，从而证实斑马鱼Iingo-1基因启动子的核苷酸序列为SEQ ID No:1。
[0020]在本发明的一个优选实施方案中，Iingo-1重组表达载体通过将斑马鱼Iingo-1基因启动子序列、EGFP荧光蛋白编码框(SEQ ID No:4)和SV40poly A (SEQ ID No:5)(pEGFP-1, clontech)插入载体 p1-Scel-pBSI1-SK+(Genbank:DQ836146,参见 Thermes, V.，et al 2002，其中 pBSI1-SK+可购自 Stratagene)中而得到。
[0021]本发明构建的Iingo-1重组表达载体可通过多种方法导入斑马鱼受精卵，如显微注射法、原生质体融合法或高压电穿孔法等，优选为显微注射法。同时，本发明人发现，核酸内切酶1-SceI (R0694,NEB)的使用可提高了斑马鱼转基因瞬时表达和稳定性表达的效率。
[0022]本发明的Iingo-1重组表达载体中包含lingo-1基因启动子,而lingo-1可特异性标记后期成熟的少突胶质细胞。因此，本发明的Iingo-1特异性基因表达的转基因斑马鱼可活体实时的监测荧光信号，从而快速直观地反映zLINGO-1的表达水平，也可以在位活体动态观察少突胶质细胞行为和髓鞘再生过程。本发明为研究CNS损伤后髓鞘修复过程中少突胶质细胞和髓鞘的动态变化过程奠定了基础，对治疗人类CNS脱髓鞘疾病具有积极意义。
[0023]因此，本发明还提供利用本发明的方法构建的转基因斑马鱼的应用，其可以用于构建筛选影响少突胶质细胞分化成熟的药物或化合物的模型和筛选影响少突胶质细胞再髓鞘化的药物或化合物的模型。
[0024]本发明还提供一种影响少突胶质细胞分化成熟的药物或化合物筛选模型，所述筛选模型包括野生型斑马鱼与利用本发明的方法构建的lingo-1:荧光蛋白品系杂交得到的杂合斑马鱼幼鱼。
[0025]本发明还提供一种影响少突胶质细胞再髓鞘化的药物或化合物筛选模型，所述筛选模型包括野生型斑马鱼与利用本发明的方法构建的lingo-1:荧光蛋白品系杂交得到的杂合斑马鱼成鱼。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，
[0027]其中:
[0028]图1 为 Iingo-1 重组表达载体 p1-Scel-lingol-EGFP ；
[0029]图2为4dpf的转基因斑马鱼Tgdingol::EGFP)R)代；
[0030]图3 为 Iingo-1 重组表达载体 pl-Scel-lingol-mCherry ；
[0031]图4 为 4dpf 的双转基因斑马鱼 Tg(olig2::EGFP)/pl-Scel-lingol-mCherry,
[0032]用于验证斑马鱼Iingo-1基因启动子特异性。
【具体实施方式】
[0033]以下通过具体实施例的方式详细说明本发明，但是，本领技术人员应该理解，本发明并不局限于这些具体的实施例，本发明的技术方案的任何等价替换、改进和变化都包括在本发明的范围之内。`
[0034]本领域技术人员应该理解，除非另外说明，下述实施例中所用的试剂、质粒均可商业获得。
[0035]实施例1培育Iingo-1转基因斑马鱼
[0036](I)构建Iingo-1重组表达载体
[0037]使用Hind III 和 Xho I 双酶切质粒 pEGFP-1 (购自 BD Biosciences Clontech)得到约IKb的EGFP荧光蛋白编码框和SV40poly A片段；设计斑马鱼Iing0-1基因启动子特异性引物(见下表1)并进行基因组PCR后，回收纯化目的片段使用BamH I和Hind III双酶切得到约2Kb的Iingo-1基因启动子序列(SEQ ID No:1);用BamH I和Xho I双酶切质粒 p1-Scel-pBSI1-SK+(Genbank:DQ836146，参见 Thermes，V., et al 2002，其中 pBSI1-SK+可购自 Stratagene)。
[0038]得到约3Kb片段；同时连接上述三个片段，得到重组载体p1-Sce1-lingol-EGFP(SEQ ID No:2)。
[0039]表1.斑马鱼Iingo-1基因启动子特异性引物:
[0040]
引物名称序列
正向引物:__5’ -GCggatccTGAAGAGCGGTTCCATAAAGC-3’_
反向引物:5’-CCaagcttCACCCGCTCACATACATGCC-3’
[0041]所构建的Iingo-1重组表达载体p1-Scel-lingol-EGFP如图1所示,其包含核酸内切酶1-SceI限制酶切位点、斑马鱼Iingo-1基因启动子序列、EGFP荧光蛋白编码框和SV40poly A0该lingo-1重组表达载体进一步用于构建转基因斑马鱼。
[0042](2)重组表达载体p1-Scel-lingol-EGFP转化斑马鱼受精卵[0043]对斑马鱼受精卵(AB/WT野生型斑马鱼，饲养于本室的ESEN循环系统，斑马鱼最初购自国家斑马鱼模式动物中心)显微共注射重组表达载体p1-Scel-lingol-EGFP和核酸内切酶1-Scel，得到R)代，于受精后四天(4dpf)使用荧光体式显微镜(SZX-16，OLYMPUS)筛选荧光信号，如图2所示。
[0044](3)斑马鱼Iingo-1基因启动子特异性的验证
[0045]针对质粒pCDNA-mCherry中 mCherry 突光蛋白编码框(SEQ ID No:6)和 BGH polyA片段(SEQ ID No:7)设计特异性引物进行PCR扩增后使用Hind III和Xho I双酶切得到约IKb的mCherry荧光蛋白编码框和BGH poly A片段；设计斑马鱼Iing0-1基因启动子特异性引物(见表1)并进行基因组PCR后，回收纯化目的片段使用BamH 1和Hind III双酶切得到约2Kb的Iingo-1基因启动子序列；用8&11111 1和Xho 1双酶切质粒p1-Scel-pBSI1-SK+得到约3Kb片段；连接上述三个片段,得到重组载体pl-Scel-lingo 1-mCherry (SEQ ID No:3)。
[0046]所构建的Iingo-1重组表达载体pl-Scel-lingol-mCherry如图3所示,其包含核酸内切酶1-SceI限制酶切位点、斑马鱼Iingo-1基因启动子序列、mCherry荧光蛋白编码框和BGH poly A，用于验证斑马鱼lingo-1基因启动子特异性。
[0047]通过显微注射将Iingo-1重组表达载体pl-Scel-lingol-mCherry导入转基因斑马鱼Tg(olig2::EGFP)(特异性标记少突胶质细胞前体细胞OPC的转基因品系，该品系最初由美国Bruce Appel组构建，获自国家斑马鱼模式动物中心)得到代，于受精后四天(4dpf)使用激光共聚焦显微镜(FV-1000，OLYMPUS)检测红/绿色荧光信号是否共定位，从而来验证斑马鱼Iingol基因启动子的特异性，如图4所示，图4显示在脑部与脊髓处有部分的红/绿荧光信号共定位，说明在olig2阳性细胞上有mCherry的特异性表达，即Iingo-1启动子可以调控目标蛋白在少突胶质细胞上特异性表达，从而验证了斑马鱼Iingo-1基因启动子序列的特异性。
[0048]实施例2.影响少突胶质细胞分化成熟的药物或化合物筛选
[0049]将AB野生型(购自国家斑马鱼模式动物中心)和按照实施例1的方法得到的Iingo-1iEGFP品系杂交获得lingo-1:EGFP/AB杂合斑马鱼幼鱼用于筛选。
[0050]例如利用已有的化学合成物文库Prestwick Chemical Library(Prestwick-Chemical),选择约一千种化合物进行初步筛选(实验室小规模筛选)。将所选的化合物借助IOmM的DMSO配制终浓度为IOuM的化合物工作液，将3条30hpflingo-1:EGFP/AB幼鱼/孔(每种化合物9条)和200ul化合物工作液/孔置于96孔平板中并饲养至72hpf。首先检测毒性作用，将没有毒性作用的化合物组内的幼鱼用4% PFA固定，并于荧光体式显微镜(SZX-16，OLYMPUS)检测荧光信号，并使用DP_72 (OLYMPUS)拍照，并统计1ingo-1+细胞的迁移数目。进一步改变相应化合物的浓度，若在浓度梯度实验中出现同样的效应，则使用Q-PCR检测mbp的RNA水平变化。
[0051]本领域技术人员应该理解，利用该lingo-1:EGFP/AB杂合斑马鱼幼鱼筛选模型按上述操作步骤可以进行高通量筛选，可以筛选得到影响少突胶质细胞分化成熟的药物或化合物。
[0052]实施例3.影响少突胶质细胞再髓鞘化的药物或化合物筛选
[0053]将AB野生型和lingo-1:EGFP品系杂交获得lingo-1:EGFP/AB杂合斑马鱼成鱼(> 6mpf)用于筛选。构建成鱼视神经脱髓鞘模型(5号镊CRUSH或者视神经微注LPC)，将待筛选的化合物溶解并吸收到药用海绵中并包裹视神经。于手术7天后将成鱼麻醉并取出视神经，4% PFA固定后，冰冻切片并使用免疫组化技术研究少突胶质细胞(EGFP+)和髓鞘化情况(使用斑马鱼MBP抗体，由Abmart合成)。
[0054]本领域技术人员应该理解，利用该lingo-1:EGFP/AB杂合斑马鱼成鱼筛选模型按上述操作步骤可以进行高通量筛选，可以筛选得到影响少突胶质细胞再髓鞘化的药物或化合物。
[0055]应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组
入
口 o
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【权利要求】
1.斑马鱼lingo-1基因启动子，其核苷酸序列为SEQID No:1。
2.一种包含斑马鱼Iingo-1基因启动子、荧光蛋白编码框和poly A片段的重组载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其中所述重组载体的核苷酸序列为SEQID No:2,其中所述荧光蛋白为EGFP，所述poly A片段为SV40polyA片段。
4.一种包含权利要求2或3所述的重组载体的宿主细胞。
5.一种培育Iingo-1转基因斑马鱼的方法，所述方法包括以下步骤: (1)构建Iingo-1重组表达载体,所述Iingo-1重组表达载体包含适当的核酸内切酶酶切位点，斑马鱼Iingo-1基因启动子序列，荧光蛋白编码框和poly A片段； (2)用步骤(1)中的重组表达载体转化斑马鱼受精卵，得到代；和 (3)将R)代与野生型的斑马鱼杂交，得到Iingo-1特异性基因标记的转基因斑马鱼。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述步骤(1)中所用的核酸内切酶酶切位点为1-SceI限制酶酶切位点或Tol2转座酶酶切位点；所述荧光蛋白选自EGFP、mCherry, RFP、YFP或DsRED ;所述poly A片段选自SV40 polyA片段或BGH poly A片段。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述步骤(1)中，将斑马鱼Iingo-1基因启动子序列、荧光蛋白编码框和poly A片段插入到载体p1-Scel-pBSI1-SK+中，得到所述Iingo-1重组表达载体。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述Iingo-1重组表达载体通过显微注射法、原生质体融合法或高压电穿孔法导入斑马鱼受精卵，得到代。
9.一种影响少突胶质细胞分化成熟的药物或化合物筛选模型，所述筛选模型包括野生型斑马鱼与利用权利要求5的方法构建的lingo-1:荧光蛋白品系杂交得到的杂合斑马鱼幼鱼。
10.一种影响少突胶质细胞再髓鞘化的药物或化合物筛选模型，所述筛选模型包括野生型斑马鱼与利用权利要 求5的方法构建的lingo-1:荧光蛋白品系杂交得到的杂合斑马鱼成鱼。
【文档编号】C12N15/63GK103805601SQ201210452397
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2012年11月12日 优先权日:2012年11月12日
【发明者】殷梧, 胡兵 申请人:中国科学技术大学