一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法
【专利摘要】本发明公开了一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法，属于植物组织培养【技术领域】。在不同的激素及活性炭配比浓度下，以改良WPM为基本培养基，樟叶越桔幼嫩茎段为外植体进行组培苗培养系的建立及咖啡酰熊果苷含量的测定。只需通过调节6-BA与NAA及活性炭的配比就可以控制无菌苗的生长及生根诱导。外植体诱导率达97％，芽苗健壮，生长快，芽苗生根率达94％，且根系健壮。具有繁殖速度快、周期短、咖啡酰熊果苷含量高等优点，是大量获取咖啡酰熊果苷的有效途径，并为樟叶越桔优良快繁苗的规模化生产提供可靠的技术依据。
【专利说明】一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组织培养【技术领域】，具体涉及一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法。
【背景技术】
[0002]樟叶越桔(Vacciniumdunalianum)是杜胃$花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物，常绿灌木。主产于云南、四川、贵州、西藏等地，我国台湾以及锡金、不丹、印度(东北部)、緬甸(东北部)至越南亦有分布，在云南省境内则主要分布于云南西北部经滇中高原至滇南和滇东南。其幼嫩叶芽，因形似雀嘴呈锥状，在云南彝族民间又称“雀嘴茶”，据记载自明代开始就作为一种茶代用品长期饮用至今，具有祛风除湿、舒筋活络等功效。越桔属植物富含多种营养成分，并具有多方面的生理活性，同时也是广泛应用于化妆品行业的熊果苷(arbutin)原料的主要植物来源之一。熊果苷是源于绿色植物的天然活性物质，是当今流行的最为安全有效的美白原料，也是国际公认的二十一世纪的理想皮肤美白祛斑活性剂。由于熊果苷作为次生代谢产物通常以微量形式存在于植物体中，且天然植物来源困难，因此，筛选熊果苷高产天然植株或寻找熊果苷天然替代品已经成为当务之急。
[0003] 申请人:前期研究发现，樟叶越桔是一种富含咖啡酰熊果苷类物质的特殊资源植物，其中6’ -O-咖啡酰熊果苷的得率高达植物材料干重的22% (Zhao P, TanakaT, Hirabayashi K, et al, 2008.Caffeoyl arbutin and related compounds from the buds ofVaccinium dunalianum.Phytochemistry, 69(18): 3087-3094.),并对其制备方法进行了专利保护(赵平，张颖君，许敏，杨崇仁，2007.6’-0_咖啡酰基熊果甙的制备方法.授权专利号:ZL200710065956.X)。生物活性研究结果表明，该化合物的酪氨酸酶抑制活性和抗氧化等活性均优于熊果苷，且毒性仅为熊果苷的1/2，可望作为熊果苷天然替代品加以应用，具有重要的开发价值。由于樟叶越桔处于野生状态，生长缓慢，分布有限，加之随着雀嘴茶的关注度不断提高，导致其连年遭受破坏性采摘，野生樟叶越桔数量急剧减少。现有技术目前尚无采用组织培养技术获得高含量咖啡酰熊果苷植物材料的报道，有必要采用现代生物技术手段解决当前樟叶越桔的资源匮乏问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，基于咖啡酰熊果苷在樟叶越桔植物体的分布特点及其所具有的药理活性，提供一种培养过程简单、高效且富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法。该方法具有繁殖速度快、周期短、咖啡酰熊果苷含量高等优点，是获取大量高含量咖啡酰熊果苷的樟叶越桔材料的有效途径。
[0005]为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案:
[0006]一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法，包括以下步骤:
[0007] (I)从叶越桔植株上获取当年生的樟叶越桔茎段作为外植体，外植体剪除叶片剪成4~6cm长的茎段，用洗洁精水浸泡30~60min，流水冲洗I~2h后再用酒精和升汞消毒，消毒后用无菌水冲洗，无菌条件下切成带I~2个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基上进行培养，叶腋处诱导出腋芽后继续培养；所述的腋芽诱导培养基为:WMP+6-BA1.0 ~3.0mg/L+NAA0.5 ~1.5mg/L+ 活性炭 2.0 ~3.0g/L, ρΗ5.4 ~5.8。
[0008](2)腋芽的增殖诱导:待腋芽长成3cm以上的小苗后，将其切成1.5~2cm长带I~3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行培养；培养至小苗长至3~4cm高且叶腋处可诱导出新的不定芽小苗即得到樟叶越桔组培苗；反复将3~4cm高的组培苗切成1.5~2cm长带I~3个叶腋的茎段在腋芽增殖培养基上进行增殖培养，可以使得樟叶越桔进行快速大量的扩繁；所述的腋芽增殖培养基为:WMP+6-BAl.0~3.0mg/L+NAA0.2 ~1.0mg/L+ 活性炭 1.0 ~2.0g/L, ρΗ5.4 ~5.8。
[0009](3)樟叶越桔组培苗的生根诱导:将樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中培养诱导生根得到樟叶越桔生根苗；所述的生根培养基为:WMP+6-BA0.5~1.5mg/L+NAA0.1~1.0mg/L+ 活性炭 0.1 ~1.0g/L, ρΗ5.4 ~5.8。
[0010]步骤(1)中所述的消毒优选为:用75%酒精浸泡15~30s，再用0.1 %升汞浸泡7 ~12min0
[0011]步骤(1)中所述的培养条件优选为:培养温度25±2°C，光照强度2000~25001x，光照周期比14~15h:9~IOh0
[0012]步骤⑵中所述的培养条件优选为:培养温度27±2°C，光照强度2100~23001x，光照周期比12h:12h。
[0013]步骤(3)中所述的培养条件优选为:培养温度28±2°C，光照强度1700~18001x，光照周期比10h: 14h 。
[0014]上述方法中腋芽诱导培养基、腋芽增殖培养基和生根培养基中的凝胶剂可以是琼脂或卡拉胶，其终浓度优选为4~5g/L ;培养基中的蔗糖为食用白糖，其终浓度优选为20~30g/L ;培养基中的水为自来水；培养基的pH值优选为用Imol/LNaOH或HCl来调节。
[0015]上述富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法还可进一步包括咖啡酰熊果苷含量的测定。
[0016]优选的，咖啡酰熊果苷含量的测定方法包括如下步骤:
[0017](I)将样品在自然条件下风干、粉碎后称取0.5g置于IOmL容量瓶中，加入60%甲醇10mL，称重，超声3次，每次30min，静置24h后用60%甲醇补足至前面所称重量，过微孔滤膜d = 0.45 μ m，得供试样品溶液。
[0018](2)高效液相色谱(HPLC)测定咖啡酰熊果苷的含量，条件如下:色谱柱AgilentAnalytical Eclipse XDB-C18 (4.6mmX 150mm, 0.5 μ m),流动相:甲醇 / 水体系(含冰醋酸I % ),洗脱体系:0~5min5 %甲醇，5~10min5 %~15 %甲醇，10~50minl5 %~65 %甲醇，50~55min65%~95%甲醇，流速:1.0mL/min，进样量40 μ L，检测波长280nm，柱温30°C ;通过咖啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测定，对照品线性方程为y =1152.3x+190.03，R2 = 0.9998。
[0019]与现有技术相比，本发明的优异性在于:
[0020](I)本发明使用的改良WPM培养基比传统的WPM基本培养基更有利于樟叶越桔无菌苗的诱导、增殖和生长。
[0021](2)所使用的蔗糖为食用白糖，水为民用自来水，价格低廉，来源广泛。[0022](3)本发明的特点在于激素配比简单，可靠调节激素及活性炭的配比来控制无菌苗的生长或生根诱导。
[0023](4)本发明方法外植体诱导率达97%，芽苗健壮，生长快，芽苗生根率达94%，且根系健壮；本发明方法周期短，成本低，完全能满足大面积规模化栽培的需求，具有良好的应用前景。
[0024]本方法结合了微型扦插及组织培养的技术，从幼嫩樟叶越桔的茎段叶腋处诱导出腋芽，待长成无菌苗后不断诱导扩繁，不经脱分化和再分化，周期短，遗传性状稳定，芽苗健壮，培养过程简单。另一方面，经高效液相色谱检测发现樟叶越桔组培苗中含有高含量咖啡酰熊果苷物质。樟叶越桔组织培养方法的建立，是大量获取咖啡酰熊果苷的有效途径，并可为樟叶越桔优良快繁苗的规模化生产提供可靠的技术依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图为本发明做进一步的详细描述，其中:
[0026]图1为本发明实施例1中得到的樟叶越桔组培苗生根照片。
[0027]图2为本发明实施例2中得到的樟叶越桔组培苗高效液相色谱图。
【具体实施方式】
[0028]通过以下实施例对本发明做进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。 [0029]实施例1
[0030](I)腋芽诱导的启动培养
[0031]在健壮的樟叶越桔植株上获取当年生幼嫩的樟叶越桔茎段作为外植体，外植体剪除叶片剪成4~6cm长的茎段，用洗洁精水浸泡30~60min，流水冲洗I~2h后进行消毒，消毒采用75%的酒精和0.1 %的升汞组合，75%酒精浸泡15~30s，0.1 %升汞浸泡7~12min,消毒后用无菌水冲洗4~5次，于消毒过的滤纸上将其切成带I~2个叶腋的茎段并吸干茎段上的水分，然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基(WPM+6-BA2.5mg/L+NAAl.0mg/L+活性炭2.5g/L，其中白糖20~30g/L、琼脂4-6g/L，ρΗ5.5)上培养，培养温度为25±2°C,光照强度为20001x，光照周期比14h:10h。培养25d后，芽诱导率为95%。
[0032](2)腋芽的增殖诱导
[0033]待腋芽长成3cm以上的小苗后，将其切成1.5~2cm长带I~3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基(WPM+6-BA2.0mg/L+NAA0.8mg/L+活性炭1.5g/L，其中白糖20~30g/L、琼脂4~6g/L，pH5.6)中进行培养，培养温度27±2°C，光照强度23001x，光照周期比12h: 12h。30d后，小苗可长至3~4cm高，同时在叶腋处可诱导出新的不定芽小苗，反复将3~4cm高的小苗切成1.5~2cm长带I~3个叶腋的茎段转到相同的腋芽增殖培养基上进行增殖培养，可以使得樟叶越桔进行快速大量的扩繁，其增殖系数为3。
[0034](3)樟叶越桔组培苗的生根诱导
[0035]将生长健壮的组培苗转接于生根培养基(WPM+6-BA1.3mg/L+NAA0.8mg/L+活性炭
0.8g/L，其中白糖20~30g/L、琼脂4-6g/L，ρΗ5.8)中培养，培养温度28±2°C，光照强度18001x，光照周期比10h:14h。培养35d后，组培苗(见图1)即可生长出数条根系，生根率为 92%0
[0036]樟叶越桔组培苗中咖啡酰熊果苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测定，按
【发明内容】
中的方法制备供试样品溶液，HPLC条件如下:Agilent Analytical EclipseXDB-C18 (4.6mmX 150mm, 0.5 μ m)色谱柱，流动相:甲醇/水体系(含冰醋酸I % )，洗脱体系:0~5min5 %甲醇，5~10min5 %~15 %甲醇，10~50minl5 %~65 %甲醇，50~55min65%~95%甲醇，流速:1.0mL/min,进样量40 μ L，检测波长280nm，柱温30°C，通过咖啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测定(咖啡酰熊果苷保留时间为26min)，对照品线性方程为 y = 1152.3x+190.03，R2 = 0.9998。
[0037]经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的樟叶越桔组培苗中咖啡酰熊果苷的含量为 0.132%。
[0038]实施例2
[0039](I)腋芽诱导的启动培养
[0040]在健壮的樟叶越桔植株上获取当年生幼嫩的樟叶越桔茎段作为外植体，外植体剪除叶片剪成4~6cm长的茎段，用洗洁精水浸泡30~60min，流水冲洗I~2h后进行消毒，消毒采用75%的酒精和0.1 %的升汞组合，75%酒精浸泡15~30s，0.1 %升汞浸泡7~12min,消毒后用无菌水冲洗4~5次，于消毒过的滤纸上将其切成带I~2个叶腋的茎段并吸干茎段上的水分，然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基(WPM+6-BA2mg/L+NAAl.5mg/L+活性炭3g/L，其中白糖20~30g/L、琼脂4~6g/L，ρΗ5.4)上培养，培养温度为27 + 2V,光照强度为25001χ，光照周期比15h:9h。培养30d后，芽诱导率为92%。
[0041](2)腋芽的增殖诱导
[0042]待腋芽长成3cm以上的小苗后，将其切成1.5~2cm长带I~3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基(WPM+6-BA2.0mg/L+NAAl.0mg/L+活性炭1.3g/L，其中白糖20~30g/L、琼脂4~6g/L，pH5.6)中进行培养，培养温度28±2°C，光照强度21001x，光照周期比12h: 12h。30d后，小苗可长至3~4cm高，同时在叶腋处可诱导出新的不定芽小苗，反复将3~4cm高的小苗切成1.5~2cm长带I~3个叶腋的茎段转到相同的腋芽增殖培养基上进行增殖培养，可以使得樟叶越桔进行快速大量的扩繁，其增殖系数为3。
[0043](3)樟叶越桔组培苗的生根诱导
[0044]将生长健壮的组培苗转接于生根培养基(WPM+6-BA1.3mg/L+NAA0.7mg/L+活性炭
0.9g/L，其中白糖20~30g/L、琼脂4~6g/L，pH5.8)中培养，培养温度26±2°C，光照强度17001x，光照周期比10h:14h。培养35d后，组培苗即可生长出数条根系，生根率为94%。
[0045]樟叶越桔组培苗中咖啡酰熊果苷的含量用高效液相色谱(HPLC)测定，按
【发明内容】
中的方法制备供试样品溶液，HPLC条件如下:Agilent Analytical EclipseXDB-C18 (4.6mmX 150mm, 0.5 μ m)色谱柱，流动相:甲醇/水体系(含冰醋酸I % )，洗脱体系:0~5min5 %甲醇，5~10min5 %~15 %甲醇，10~50minl5 %~65 %甲醇，50~55min65%~95%甲醇，流速:1.0mL/min,进样量40 μ L，检测波长280nm，柱温30°C，通过咖啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测定(咖啡酰熊果苷保留时间为26min)，对照品线性方程为 y = 1152.3x+190.03，R2 = 0.9998。
[0046]经HPLC分析(图2)，得出该条件下诱导培养的樟叶越桔组培苗中咖啡酰熊果苷的含量为0.147%。
【权利要求】
1.一种富含咖啡酰熊果苷的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于包括以下步骤: (1)从叶越桔植株上获取当年生的樟叶越桔茎段作为外植体，外植体剪除叶片剪成4~6cm长的莖段,用洗洁精水浸泡30~60min,流水冲洗I~2h后再用酒精和升萊消毒，消毒后用无菌水冲洗，无菌条件下切成带I~2个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽诱导培养基上进行培养，叶腋处诱导出腋芽后继续培养；所述的腋芽诱导培养基为:WMP+6-BA1.0 ~3.0mg/L+NAA0.5 ~1.5mg/L+ 活性炭 2.0 ~3.0g/L, ρΗ5.4 ~5.8 ; (2)腋芽的增殖诱导:待腋芽长成3cm以上的小苗后，将其切成1.5~2cm长带I~3个叶腋的茎段，然后叶腋朝上斜插于腋芽增殖培养基中进行培养；培养至小苗长至3~4cm高且叶腋处可诱导出新的不定芽小苗即得到樟叶越桔组培苗；所述的腋芽增殖培养基为:WMP+6-BA1.0 ~3.0mg/L+NAA0.2 ~1.0mg/L+ 活性炭 1.0 ~2.0g/L, ρΗ5.4 ~5.8 ; (3)樟叶越桔组培苗的生根诱导:将樟叶越桔组培苗接种于生根培养基中培养诱导生根得到樟叶越桔生根苗；所述的生根培养基为:WMP+6-BA0.5~1.5mg/L+NAA0.1~1.0mg/L+ 活性炭 0.1 ~1.0g/L, pH5.4 ~5.8。
2.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于:步骤(1)中所述的消毒为:用75%酒精浸泡15~30s，再用0.1 %升汞浸泡7~12min。
3.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于:腋芽诱导培养基、腋芽增殖培养基和生根培养基中的凝胶剂是琼脂或卡拉胶，培养基中的蔗糖为食用白糖，培养基中的水为自来水，培养基PH值用Imol/LNaOH或HCl来调节。
4.根据权利要求3所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于:凝胶剂的终浓度为4~5g/L,鹿糖的终浓度为20~30g/L。
5.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于:步骤(1)中所述的培养条件为:培养温度25±2°C，光照强度2000~25001x，光照周期比14~15h:9~10h。
6.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于:步骤(2)中所述的培养条件为:培养温度27±2°C，光照强度2100~23001x，光照周期比12h:12h。
7.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于:步骤(3)中所述的培养条件为:培养温度28±2°C，光照强度1700~18001x，光照周期比10h: 14h。
8.根据权利要求1所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于:还包括咖啡酰熊果苷含量的测定。
9.根据权利要求8所述的樟叶越桔的组织培养方法，其特征在于:咖啡酰熊果苷含量的测定方法包括如下步骤: (1)将样品在自然条件下风干、粉碎后称取0.5g置于IOmL容量瓶中，加入60%甲醇10mL，称重，超声3次，每次30min，静置24h后用60%甲醇补足至前面所称重量，过微孔滤膜d = 0.45 μ m,得供试样品溶液； (2)高效液相色谱测定咖啡酰熊果苷的含量,条件如下:色谱柱AgilentAnalyticalEclipse 乂08-(:18(4.6_\150_，0.5 4 111)，流动相:甲醇/水体系(含冰醋酸1% )，洗脱体系:0~5min5 %甲醇，5~10min5 %~15 %甲醇，10~50minl5 %~65 %甲醇，50~55min65%~95%甲醇，流速:1.0mL/min,进样量40 μ L，检测波长280nm，柱温30°C;通过咖啡酰熊果苷标准品的面积外标法进行含量测定，对照品线性方程为y= 1152.3x+190.03,R2=0.9998。
【文档编号】A01H4/00GK103999773SQ201410226087
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月27日 优先权日:2014年5月27日
【发明者】赵平, 唐军荣, 罗旭璐, 阚欢, 刘云, 李旭 申请人:昆明凌览生物科技有限公司