脱除掌叶半夏病毒的方法

脱除掌叶半夏病毒的方法
【专利摘要】本发明属于作物脱除病毒的方法，特别是指一种脱除掌叶半夏病毒的方法。采用低温处理、高温处理、消毒处理、切取珠芽培养、丛芽培养或诱导、生根培养；二次脱毒；经病毒检测、获得脱毒原种苗；经组培扩繁、炼苗移栽等方法获得掌叶半夏脱毒种苗。本发明解决了掌叶半夏脱除病毒技术问题，为生产提供脱毒掌叶半夏种苗，具有原理运用得当，方法易行，可有效为掌叶半夏的人工大面积种植，提高掌叶半夏的产量和进一步保障其质量等优点。
【专利说明】
【技术领域】
[0001] 本发明属于作物脱除病毒的方法，特别是指一种脱除掌叶半夏病毒的方法。 脱除掌叶半夏病毒的方法

【背景技术】
[0002] 掌叶半夏（Pinellia pedatisecta Schott)为天南星科半夏属植物，又名虎掌南 星，多年生草本。叶片掌状分裂，小叶9-11片，叶柄纤细柔弱，淡绿色，长45?65厘米；肉穗 花序顶生，花序柄与叶柄等长或稍长；佛焰苞淡绿色，披针形，下部筒状，长圆形，先端锐尖， 长8-14厘米：花单性，无花被，雌雄同株；雄花着生在花序上端，雄蕊密集成圆筒状，长约6 毫米，
[0003] 有香蕉香气；雌花着生在花序下部，贴生于苞片上，长约1. 5厘米；花序先端附属 物线状，长约9厘米，稍弯曲。浆果卵圆形，绿色，长4-5毫米，径2?3毫米，内含种子1粒。 花期6-7月。
[0004] 掌叶半夏以块茎入药，块茎近球形，类似半夏，但较大，径约3-4厘米，外皮粗糙， 褐色，有时尚留有已枯叶柄的基部。剥去外皮为类白色而呈粉状，上部散有细凹点。本品在 江苏、河北、河南、山西等地作半夏使用。掌叶半夏块茎供药用，"味辛，性平，有毒。能化痰 止咳祛风痰、消肿，止痛，治毒蛇咬伤及无名肿毒，治口眼歪斜、半身不遂、破伤风、蛇虫咬伤 等。
[0005] 近年来掌叶半夏人工种植面积不断扩大，但掌叶半夏病毒感染严重，发病面积达 90%以上，发病植株叶片扭曲，布满褪绿病斑，为典型的烟草花叶病毒症状；由于存在掌叶 半夏田间感病植株高温夏季多发现象，可能同时也感染类病毒，类病毒高温发作，需要低温 处理方能脱除。感病植株矮化，生长缓慢，甚至整株死亡，产量和质量大幅度下降。


【发明内容】

[0006] 本发明的目的在于提供一种脱除掌叶半夏病毒的方法，以获得掌叶半夏脱毒种 苗。
[0007] 本发明的整体技术方案是：
[0008] 脱除掌叶半夏病毒的方法，包括如下工艺步骤：
[0009] a、低温处理
[0010] 在自然条件下越冬的掌叶半夏根部覆土 3-5厘米，当根部地温在一 2°C - 3°C时， 挖开根部土壤，取掌叶半夏刚刚萌动的芽尖；
[0011] b、高温处理
[0012] 将取下的芽尖涮洗干净，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，置到培养箱中进行在温 度为50°C，高温处理15分钟；
[0013] c、消毒处理
[0014] 将高温处理过的芽尖用肥皂水涮洗干净，在超净工作台上进行灭菌处理；
[0015] d、切取珠芽培养：
[0016] 将消毒好的芽尖，在超净工作台上，双目实体解剖镜下，解剖针剥取0.3-0. 5mm大 小的芽尖生长点，接种于诱导培养基进行培养，获得丛生芽或愈伤组织；
[0017] e、丛芽培养或诱导
[0018] el、获得的丛生芽可直接转接到第一分化培养基上进行分化培养；
[0019] e2、获得的愈伤组织经进一步调控培养，成疏松愈伤组织后，转接到第二分化培养 基上诱导培养丛生芽；
[0020] f、生根培养
[0021] 将步骤e中获得的丛生芽经多代分化转接，形成无根组培苗，然后转接到生根培 养基上进行生根培养，生成可移栽的瓶苗；
[0022] g、二次脱毒
[0023] 将步骤f中制成的生根瓶苗置于光照培养箱中在38°C高温处理30天，再切取茎尖 生长点，培养成植株；
[0024] h、植株病毒检测
[0025] 用酶链免疫吸附法检测步骤g中获得的植株，获得脱除了烟草花叶病毒的掌叶半 夏原种苗；
[0026] i、炼苗移栽
[0027] 利用组培快繁技术，对步骤h脱毒的掌叶半夏原种苗进行快速繁育，获得掌叶半 夏脱病毒种苗。
[0028] 本发明的具体工艺步骤和工艺方法还有：
[0029] 为对掌叶半夏根部形成较好防护，同时便于测量其根部地温，优选的实施方式是， 所述的步骤a中在掌叶半夏的根部覆土表面铺设有防护罩，采用地温表测量根部地温。
[0030] 所述的步骤a中芽尖的长度为0. 3-0. 5cm。
[0031] 所述的步骤b中将取下的芽尖用肥皂水涮洗干净。
[0032] 步骤c中的灭菌处理可以采用多种实现方式，均脱离本发明的技术实质，其中较 为常见且优选的实施方式是，所述的步骤c中的灭菌处理是采用酒精溶液将芽尖表面灭菌 10 - 20秒，然后用0. 1 %升汞溶液灭菌1-3分钟，无菌水冲洗3-5次后用灭菌滤纸吸净芽 体表面水分，以备切取珠芽。
[0033] 所述的步骤d中切取珠芽培养中诱导培养的培养基由下列组分组成：
[0034] MS+6_BA1. 0mg/kg+IBA0· 〇5mg/kg+ 鹿糖 3〇g/L+ 琼脂 5g/L，pH = 5· 8 ;
[0035] 培养条件是：温度25-28 °C，光照2000- 3000Lx。
[0036] 所述的步骤e中第一分化培养基的组成为：MS+6-BA2. 5mg/kg+IBA0. lmg/kg+鹿糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH = 5· 8 ;第二分化培养基的组成为：MS+6-BA2. 0mg/kg+IBA0· lmg/kg+ 鹿糖30g/L+琼脂5g/L。
[0037] 所述的步骤f中生根培养基的组成是：1/2MS+NAA1. 0mg/kg+鹿糖20g/L，pH = 5· 8〇
[0038] 因掌叶半夏中所存在的病毒种类目前学术界尚无明确定论，因此 申请人:采用现有 半夏中的病毒检测方法和现有掌叶半夏中公开的病毒检测方法对脱毒后的种苗进行了检 测，均未发现病毒的存在。
[0039] 本发明所具备的实质性特点和显著地技术进步在于：
[0040] 本发明利用掌叶半夏烟草花叶病毒在高温下钝化的原理，经高温钝化，切取茎尖 生长点，植株的生长点一般不带病毒；同时由于类病毒在低温下基本不活动，经过冬季低温 在第二年早春萌动的牙尖生长点基本不带病毒；经低温、高温处理，切取茎尖，培养成植株； 然后，将茎尖培养成的植株，进行第二次脱毒后培养成植株。经病毒检测，获得脱病毒掌叶 半夏植株。通过本发明的方法能有效获得脱毒掌叶半夏种苗，为掌叶半夏的人工大面积种 植、提高掌叶半夏的产量和质量提供了技术支撑。

【具体实施方式】
[0041] 以下结合实施例本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护 范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书作出的等效技术手段替换，均不脱离本 发明的保护范围。
[0042] 实施例1
[0043] 脱除掌叶半夏病毒的方法，包括如下工艺步骤：
[0044] a、低温处理
[0045] 在自然条件下越冬的掌叶半夏根部覆土 3-5厘米，当根部地温在一 2°C - 3°C时， 挖开根部土壤，取掌叶半夏刚刚萌动的芽尖；
[0046] b、高温处理
[0047] 将取下的芽尖涮洗干净，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，置到培养箱中进行在温 度为50°C，高温处理15分钟；
[0048] c、消毒处理
[0049] 将高温处理过的芽尖用肥皂水涮洗干净，在超净工作台上进行灭菌处理；
[0050] d、切取珠芽培养：
[0051] 将消毒好的芽尖，在超净工作台上，双目实体解剖镜下，解剖针剥取0.3-0. 5_大 小的芽尖生长点，接种于诱导培养基进行培养，获得丛生芽或愈伤组织；
[0052] e、丛芽培养或诱导
[0053] el、获得的丛生芽可直接转接到第一分化培养基上进行分化培养；
[0054] e2、获得的愈伤组织经进一步调控培养，成疏松愈伤组织后，转接到第二分化培养 基上诱导培养丛生芽；
[0055] f、生根培养
[0056] 将步骤e中获得的丛生芽经多代分化转接，形成无根组培苗，然后转接到生根培 养基上进行生根培养，生成可移栽的瓶苗；
[0057] g、二次脱毒
[0058] 将步骤f中制成的生根瓶苗置于光照培养箱中在38°C高温处理30天，再切取茎尖 生长点，培养成植株；
[0059] h、植株病毒检测
[0060] 用酶链免疫吸附法检测步骤g中获得的植株，获得脱除了烟草花叶病毒的掌叶半 夏原种苗；
[0061] i、炼苗移栽
[0062] 利用组培快繁技术，对步骤h中获得的脱毒掌叶半夏原种苗进行快速繁育，长至 3-5cm，球茎长至0. 5 cm以上，在蛭石基质上进行移栽炼苗，获得掌叶半夏脱病毒种苗。 [0063] 本实施例中具体工艺步骤和工艺方法还有：
[0064] 为对掌叶半夏根部形成较好防护，同时便于测量其根部温度，优选的实施方式是， 所述的步骤a中在掌叶半夏的根部覆土表面铺设有防护罩，采用地温表测量根部地温。
[0065] 所述的步骤a中芽尖的长度为0· 5cm。
[0066] 所述的步骤b中将取下的芽尖用肥皂水涮洗干净。
[0067] 步骤c中的灭菌处理可以采用多种实现方式，均脱离本发明的技术实质，其中较 为常见且优选的实施方式是，所述的步骤c中的灭菌处理是采用酒精溶液将芽尖表面灭菌 13秒，然后用0. 1 %升汞溶液灭菌2分钟，无菌水冲洗5次后用灭菌滤纸吸净芽体表面水 分，以备切取珠芽。
[0068] 所述的步骤d中切取珠芽培养中诱导培养的培养基由下列组分组成：
[0069] MS+6_BA1. 0mg/kg+IBA0· 〇5mg/kg+ 鹿糖 3〇g/L+ 琼脂 5g/L，pH = 5· 8 ;
[0070] 培养条件是：温度28°C，光照2000Lx。
[0071] 所述的步骤e中第一分化培养基的组成为：MS+6-BA2. 5mg/kg+IBA0. lmg/kg+鹿糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH = 5· 8 ;第二分化培养基的组成为：MS+6-BA2. 0mg/kg+IBA0· lmg/kg+ 鹿糖30g/L+琼脂5g/L。
[0072] 所述的步骤f中生根培养基的组成是：1/2MS+NAAL 0mg/kg+鹿糖20g/L，pH = 5· 8〇
[0073] 实施例2
[0074] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0075] 所述的步骤a中芽尖的长度为0· 3cm。
[0076] 所述的步骤c中的灭菌处理是采用酒精溶液将芽尖表面灭菌10秒，然后用0. 1% 升汞溶液灭菌1分钟，无菌水冲洗3次后用灭菌滤纸吸净芽体表面水分，以备切取珠芽。
[0077] 所述的步骤d中培养条件是：温度25°C，光照3000LX。
[0078] 其余内容同实施例1。
[0079] 实施例3
[0080] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0081] 所述的步骤a中芽尖的长度为0. 5cm。
[0082] 所述的步骤c中的灭菌处理是采用酒精溶液将芽尖表面灭菌20秒，然后用0. 1% 升汞溶液灭菌3分钟，无菌水冲洗5次后用灭菌滤纸吸净芽体表面水分，以备切取珠芽。
[0083] 所述的步骤d中培养条件是：温度28°C，光照2000LX。
[0084] 其余内容同实施例1。
[0085] 实施例4
[0086] 本实施例与实施例1的区别在于：
[0087] 所述的步骤a中芽尖的长度为0· 4cm。
[0088] 所述的步骤c中的灭菌处理是采用酒精溶液将芽尖表面灭菌15秒，然后用0. 1% 升汞溶液灭菌2分钟，无菌水冲洗4次后用灭菌滤纸吸净芽体表面水分，以备切取珠芽。
[0089] 所述的步骤d中培养条件是：温度26°C，光照2500LX。
[0090] 其余内容同实施例1。
【权利要求】
1.脱除掌叶半夏病毒的方法，其特征在于包括如下工艺步骤： a、 低温处理 在自然条件下越冬的掌叶半夏根部覆土 3-5厘米，当根部地温在一 2°C-3°C时，挖开 根部土壤，取掌叶半夏刚刚萌动的芽尖； b、 高温处理 将取下的芽尖涮洗干净，置于铺有湿润滤纸的培养皿中，置到培养箱中进行在温度为 50°C，高温处理15分钟； c、 消毒处理 将高温处理过的芽尖用肥皂水涮洗干净，在超净工作台上进行灭菌处理； d、 切取珠芽培养： 将消毒好的芽尖，在超净工作台上，双目实体解剖镜下，解剖针剥取〇. 3-0. 5mm大小的 芽尖生长点，接种于诱导培养基进行培养，获得丛生芽或愈伤组织； e、 丛芽培养或诱导 el、获得的丛生芽可直接转接到第一分化培养基上进行分化培养； e2、获得的愈伤组织经进一步调控培养，成疏松愈伤组织后，转接到第二分化培养基上 诱导培养丛生芽； f、 生根培养 将步骤e中获得的丛生芽经多代分化转接，形成无根组培苗，然后转接到生根培养基 上进行生根培养，生成可移栽的瓶苗； g、 二次脱毒 将步骤f中制成的生根瓶苗置于光照培养箱中在38°C高温处理30天，再切取茎尖生长 点，培养成植株； h、 植株病毒检测 用酶链免疫吸附法检测步骤g中获得的植株，获得脱除了烟草花叶病毒的掌叶半夏原 种苗； i、 炼苗移栽 利用组培快繁技术，对步骤h中获得的脱毒掌叶半夏原种苗进行快速繁育，获得掌叶 半夏脱病毒种苗。
2. 根据权利要求1所述的脱除掌叶半夏病毒的方法，其特征在于所述的步骤a中在掌 叶半夏的根部覆土表面铺设有防护罩，采用地温表测量根部地温。
3. 根据权利要求1所述的脱除掌叶半夏病毒的方法，其特征在于所述的步骤a中芽尖 的长度为〇. 3-0. 5cm。
4. 根据权利要求1所述的脱除掌叶半夏病毒的方法，其特征在于所述的步骤b中将取 下的芽尖用肥皂水涮洗干净。
5. 根据权利要求1所述的脱除掌叶半夏病毒的方法，其特征在于所述的步骤c中的灭 菌处理是采用酒精溶液将芽尖表面灭菌10 - 20秒，然后用0. 1 %升汞溶液灭菌1-3分钟， 无菌水冲洗3-5次后用灭菌滤纸吸净芽体表面水分，以备切取珠芽。
6. 根据权利要求1所述的脱除掌叶半夏病毒的方法，其特征在于所述的步骤d中切取 珠芽培养中诱导培养的培养基由下列组分组成： MS+6-BA1. Omg/kg+IBAO. 05mg/kg+ 鹿糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH = 5· 8 ; 培养条件是：温度25-28°C，光照2000- 3000Lx。
7. 根据权利要求1所述的脱除掌叶半夏病毒的方法，其特征在于所述的步骤e中第一 分化培养基的组成为：MS+6-BA2. 5mg/kg+IBA0. lmg/kg+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂 5g/L，pH = 5. 8 ; 第二分化培养基的组成为：MS+6-BA2. Omg/kg+IBAO. lmg/kg+鹿糖30g/L+琼脂5g/L。
8. 根据权利要求1所述的脱除掌叶半夏病毒的方法，其特征在于所述的步骤f中生根 培养基的组成是：1/2MS+NAA1. 0mg/kg+ 蔗糖 20g/L，pH = 5. 8。
【文档编号】A01H4/00GK104082149SQ201410359931
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年7月25日 优先权日:2014年7月25日
【发明者】温春秀, 谢晓亮, 刘灵娣, 贾东升, 刘铭, 田伟, 边建波 申请人:谢晓亮