玉米抗丝黑穗病相关基因ZmNL的克隆鉴定及其在抗丝黑穗病玉米育种中的用途
【专利摘要】本发明公开了玉米抗丝黑穗病相关基因ZmNL的克隆鉴定及其在抗丝黑穗病玉米育种中的用途。研究表明，该基因位于玉米主效抗丝黑穗病区域(bni2.09)区域内，受到丝轴黑粉菌胁迫后，其表达量在抗病玉米材料中显著高于感病材料。其编码的蛋白为膜蛋白，多表达于内质网膜及质膜上，具有R蛋白的保守基序。原核表达试验证明该基因的编码蛋白能够抑制丝轴黑粉菌的生长。转化该基因的玉米株系人工接种丝轴黑粉菌后发病率显著低于未接种的受体对照材料。本发明所提出的ZmNL基因对玉米抗丝黑穗病的防治具有重要意义，可用于玉米抗丝黑穗病分子育种的研究。
【专利说明】玉米抗丝黑穗病相关基因 ZmNL的克隆鉴定及其在抗丝黑 穗病玉米育种中的用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及玉米抗丝黑穗病相关基因 ZmNL的克隆鉴定及其在抗丝黑穗病玉米育 种中的用途。本发明属于基因工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002] 玉米丝黑穗病（Sphacelotheca reiliana(Kiihn)Clint.)是世界春播干旱、冷凉玉 米产区普遍发生的真菌病害，也是我国玉米生产（北方春玉米区）上的主要病害之一。2002 年仅因玉米丝黑穗病，东北三省直接损失玉米1. 2亿kg，农民减收9600万元（以2002玉米 单价，0.8元/kg)造成相当严重的经济损失（王晓鸣等，2003)。利用栽培措施和药物防治 玉米丝黑穗病，既增加生产投入，又带来了环境污染。另外，前人研究已经发现在玉米种质 中存抗丝黑穗病材料（王振华，2004 ;孙志超，2007 ;郭满库，2007 ;王燕，2010)。因此，加强 培育和推广抗病品种是最为有效的措施，也是农业低碳和可持续发展的有效途径。抗病育 种的关键在于对抗源的把握和对抗病规律的认识。
[0003] 玉米丝黑穗病抗性属数量性状遗传，同时受到加性、显性和上位性效应协同控制 [8_ 12]，其中以加性和显性效应为主[7°]，同时抗病性与生态条件、水热条件有关，且易受母本 类型和各种修饰因子的影响。目前，关于玉米丝黑穗病的分子遗传研究主要集中在玉米丝 黑穗病抗病QTL定位和玉米丝黑穗病抗病相关候选基因挖掘两方面。
[0004] 利用不同的抗丝黑穗病玉米种质构建的定位群体（BC，F2:3等）中已经初步定位 了至少15个相关抗丝黑穗病的数量性状基因位点（QTL)，其中位于第2染色体的bin2. 09 区域的主效QTL，能在多个研究中被重复检测到，平均解释表型变异率35 %左右（LU等， 1999 ;Lu等，1999 ;Li等，2008 ;Chen等，2008 ;Shi等，2010);同时，结合分子生物信息学和 功能基因组学也挖掘出一系列抗病QTL、抗病基因类似物（RGA，Resistance Gene Analog) 和丝黑穗病抗性相关的候选基因（TUGs，tentative unique genes)(吉海莲等，2007 ;张书 红等，2007)。
[0005] 分子生物技术及生物信息技术的飞速发展为玉米丝黑穗病抗病候选基因的发掘 提供了良好的平台。倪琢（2006)以对丝黑穗病表现明显抗性差异的玉米自交系M 〇17(高 抗）和黄早四（高感）为试材，采用SSH和cDNA芯片两种功能基因研究的方法，对同一试 材幼苗期接种与不接种两种状态下所表达的差异基因进行比较分析，筛选到一些受玉米丝 黑穗病原菌侵染所诱导表达的基因，主要为赤霉素激发转录蛋白、类成熟蛋白、衰老相关蛋 白等。吉海莲等（2007)以玉米遗传连锁图谱BM22005Neighbors为参考图谱，通过映射整 合不同试验中的抗玉米丝黑穗病QTL，构建QTL综合图谱。采用元分析技术结合生物信息 学技术在2个"一致性"QTL区间内初步获得4个抗病位置候选基因。Wang等（2012)利用 MaizeSNP50芯片对两年两地144个自交系在人工接种条件下的抗性表型和SNP基因型进行 了全基因组关联分析，筛选到18个玉米丝黑穗病抗性相关候选基因，这些基因分别为抗病 基因，抗病应答基因以及植物抗病功能基因。
[0006] 目前，结合分子生物技术和生物信息技术，研究人员获得了一些抗性相关候选序 列及基因，但并未真正意义上分离、克隆到主效抗病基因。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种与玉米抗丝黑穗病相关的基因，命名为ZmNL。
[0008] 本发明的目的之二在于提供所述玉米ZmNL基因在抗丝黑穗病玉米育种中的应 用，
[0009] 本发明的目的之三在于提供所述ZmNL基因的编码蛋白在制备丝轴黑粉菌生长抑 制剂中的用途。
[0010] 本发明的目的之四在于提供一种利用所述的ZmNL基因进行抗丝黑穗病转基因玉 米育种的方法。
[0011] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0012] 本发明以玉米自交系B73RefGen_v2染色体上2. 09区域的DNA序列为研究对象， 利用在线预测基因软件Fgenesh对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，发现1个玉米抗 丝黑穗病候选基因，命名为ZmNL。该ZmNL基因全长8640bp，转录起始于1993bp，终止于 8264bp，具有典型的PolyA尾巴，为完整的基因。ZmNL基因包含两个外显子，一个内含子。 根据预测获得的玉米抗丝黑穗病候选基因 ZmNL的全长序列，通过进一步扩增最终获得玉 米抗丝黑穗病候选基因 ZmNL的cDNA编码区全长共3156bp，序列组成见SEQ ID NO. 1。研 究表明，该基因位于玉米主效抗丝黑穗病区域（bni2. 09)区域内，受到丝轴黑粉菌胁迫后， 其表达量在抗病玉米材料中显著高于感病材料。其编码的蛋白为膜蛋白，多表达于内质网 膜及质膜上，具有R蛋白的保守基序。原核表达试验证明该蛋白能抑制丝轴黑粉菌的生长， 转化该基因的玉米株系人工接种丝轴黑粉菌后发病率显著低于未接种的受体对照材料。
[0013] 因此，在上述研究的基础上，本发明提出了玉米ZmNL基因在抗丝黑穗病玉米育种 中的应用，其中，所述的ZmNL基因含一个3156bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0014] 更进一步的，本发明还提出了玉米ZmNL基因的编码蛋白在制备丝轴黑粉菌生长 抑制剂中的应用。
[0015] 其中，优选的，所述的玉米ZmNL基因的编码蛋白为玉米ZmNL基因的原核表达蛋 白。
[0016] 再进一步的，本发明还提出了一种抗丝黑穗病转基因玉米的育种方法，包括以下 步骤：
[0017] (1)合成或扩增得到玉米ZmNL基因，所述的ZmNL基因含一个3156bp的完整开放 阅读框〇RF，ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示；
[0018] (2)构建含有玉米ZmNL基因的真核表达载体；
[0019] (3)通过转基因技术手段，将玉米ZmNL基因导入玉米自交系的基因组中，筛选并 培育出抗丝黑穗病转基因玉米品种。
[0020] 在本发明所述的育种方法，优选的，步骤（2)中所述的真核表达载体是在含有除 草剂抗性基因 Bar筛选标记的基础表达载体pTFlOl. 1的基础上，引入玉米泛素 Ubiquitin 启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因 T-nos终止子，然后与合成或扩增得到玉米ZmNL基因重 组后得到的。
[0021] 在本发明所述的育种方法，优选的，步骤（3)中所述的转基因技术手段为农杆菌 介导的转化方法。
[0022] 在本发明所述的育种方法，优选的，步骤（3)中所述的玉米自交系为高感丝黑穗 病的玉米自交系黄早四。
[0023] 本发明所提出的ZmNL基因对玉米抗丝黑穗病的防治具有重要意义，可用于玉米 抗丝黑穗病分子育种的研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0024] 图1是Fgenesh软件预测基因结果；
[0025] TSS为转录起始位点；CDSf为起始外显子；CDSI为末端外显子；
[0026] 图2是丝轴黑粉菌胁迫下ZmNL基因的表达谱；
[0027] ***表示ρ〈0·001水平下差异显著
[0028] 图3是ZmNL基因 RT-PCR及RACE琼脂糖电泳检测；
[0029] a. RT-PCR电泳结果，b为Y RACE电泳结果，c为:V RACE电泳结果
[0030] M为分子量标准Trans 2k
[0031] 图4是玉米抗丝黑穗病ZmNL基因编码蛋白的保守结构域图；
[0032] 图5是ZmNL基因编码的氨基酸同其他植物同源性比较；
[0033] 红框所示为ZmNL蛋白和大多数NBS-LRR类植物R蛋白具有的相同保守基序
[0034] 图6是ZmNL蛋白的二级结构分析；
[0035] 其中α -螺旋组成（h)、延伸链区（e)、无规则卷曲（C)和β -折叠⑴分别由蓝 色、红色、黄色和红色标记
[0036] 图7是ZmNL基因原核表达载体pET32a (+) -ZmNL构建流程图；
[0037] 图8是图3-26pET32a(+)-ZmNL重组蛋白的诱导表达；
[0038] M为蛋白分子量标准marker，1为未诱导重组蛋白，2为诱导重组蛋白
[0039] 图9是ZmNL基因表达蛋白对丝轴黑粉菌抑菌特性分析；
[0040] 图10是ZmNL基因单子叶植物过表达载体PTU-ZmNL的物理图谱。
[0041] 图11是部分转基因玉米植株Bar基因的PCR检测电泳图。
[0042] M为分子量标准Trans 2K，W为水对照，-为阴性对照，+为阳性对照，1-11为转基 因植株。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于 例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0044] 实施例1.玉米抗丝黑穗病候选基因 ZmNL的预测
[0045] 本发明以玉米自交系B73RefGen_v2染色体上2. 09区域的DNA序列为研究对象， 利用在线预测基因软件Fgenesh对该段核苷酸序列进行生物信息学分析，应用NCBI网站 中的ORF Finder工具识别预测出的序列开放阅读框（ORF)，选择其中含有抗病保守结构 域的序列，其中包括：锌指结构（参与核酸和锌离子结合）、DNA聚合酶（DNA聚合酶活性中 心）、反转录酶（指示移动因子）、GTP活化蛋白（可以激活活性的酶原）、NBS及LRR结构 (抗性保守结构域）等。
[0046] 发现1个玉米抗丝黑穗病候选基因，命名为ZmNL。ZmNL基因预测结果如图1所示， ZmNL基因全长8640bp，转录起始于1993bp，终止于8264bp，具有典型的PolyA尾巴，为完整 的基因。ZmNL基因包含两个外显子，一个内含子。
[0047] 实施例2玉米抗丝黑穗病相关基因 ZmNL的时空表达分析
[0048] 为进一步揭示抗病候选基因 ZmNL是否与玉米丝黑穗病原菌（丝轴黑粉菌）胁迫 相关，本发明分别提取抗丝黑穗玉米近等基因系L282和感病轮回亲本黄早四在苗期人工 接种丝轴黑粉菌后〇d，ld，2d，3d，4d，5d，6d不同时间点叶片总RNA，以接种无菌水相同玉米 材料同一时间点叶片总RNA为对照，反转录获得cDNA，玉米Actinl (Gene ID: 100282267)基 因作为内参，利用Real-time PCR方法分析ZmNL基因在抗、感材料，接种前、后的表达变化。
[0049] 结果如图2表明在丝轴黑粉菌胁迫下，ZmNL基因在L282和黄早四中相对表达量 整体均呈现先升高后下降趋势。Od时，L282中ZmNL基因的相对表达量为2. 13,极显著高 于黄早四，说明该基因的表达在抗、感材料之间存在本底差异。l-2d时，L282中ZmNL基因 相对表达量呈逐渐上升态势，在2d时达到峰值，为4. 29 ;而黄早四中该基因相对表达量先 是小幅下降后迅速升高，同样在2d时达到峰值，为2. 99,这期间L282中目的基因相对表达 量始终极显著高于黄早四中的，说明该基因在抗病前期能够被显著诱导表达，可能参与早 期抗病反应。3-6d时，黄早四中ZmNL基因相对表达量迅速下降至本底水平，而L282则是缓 慢下降至与黄早四接近，但低于其本底水平，说明该基因并不能够被持续诱导表达，随着胁 迫时间的延长，甚至处于抑制状态。
[0050] 实施例3玉米抗丝黑穗病ZmNL基因全长cDNA序列的克隆
[0051] 根据预测获得的玉米抗丝黑穗病候选基因 ZmNL编码序列，首先利用Primerf软件 设计mZmNLF/mZmNLR特异引物，然后进行ZmNL基因 cDNA全长中间序列的扩增，预期扩增中 间序列片段长度约为700bp。
[0052] 以ZmNL基因预测序列为模板设计扩增该基因部分序列引物（mZmNL)，再根据以 获得的序列设计基因特异引物（RACE GSP)，引物序列如下（表1):
[0053] 表1玉米ZmNL基因克隆引物序列
[0054]
【权利要求】
1. 玉米ZmNL基因在抗丝黑穗病玉米育种中的用途，其特征在于，所述的ZmNL基因含一 个3156bp的完整开放阅读框ORF，ORF的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 玉米ZmNL基因的编码蛋白在制备丝轴黑粉菌生长抑制剂中的用途。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的玉米ZmNL基因的编码蛋白为玉米 ZmNL基因的原核表达蛋白。
4. 一种抗丝黑穗病转基因玉米的育种方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 合成或扩增得到玉米ZmNL基因，所述的ZmNL基因含一个3156bp的完整开放阅读 框ORF，0RF的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； (2) 构建含有玉米ZmNL基因的真核表达载体； (3) 通过转基因技术手段，将玉米ZmNL基因导入玉米自交系的基因组中，筛选并培育 出抗丝黑穗病转基因玉米品种。
5. 如权利要求4所述的育种方法，其特征在于步骤（2)中所述的真核表达载体是在 含有除草剂抗性基因Bar筛选标记的基础表达载体pTFlOl. 1的基础上，引入玉米泛素 Ubiquitin启动子和农杆菌胭脂碱合成酶基因T-nos终止子，然后与合成或扩增得到玉米 ZmNL基因重组后得到的。
6. 如权利要求4所述的育种方法，其特征在于步骤（3)中所述的转基因技术手段为农 杆菌介导的转化方法。
7. 如权利要求4所述的育种方法，其特征在于步骤（3)中所述的玉米自交系为高感丝 黑穗病的玉米自交系黄早四。
【文档编号】A01P3/00GK104404054SQ201410675794
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年11月21日 优先权日:2014年11月21日
【发明者】邸宏, 王振华, 于滔, 曾兴, 刘显君, 张 林 申请人:东北农业大学