利用混合诱导子茉莉酸甲酯和硫代硫酸银提高长春花悬浮细胞中二岐洼蕾碱的含量的方法与流程

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种在长春花悬浮细胞培养液中添加混合诱导子茉莉酸甲酯和硫代硫酸银来提高二岐洼蕾碱产量的方法。

背景技术：

长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科一种重要的药用植物，原产地中海沿岸、印度、热带美洲。中国栽培长春花的历史不长，主要在长江以南地区栽培，广东、广西、云南等省（自治区）栽培较为普遍。长春花植株中含有130多种生物碱，这些生物碱大多具有药理活性，长春碱 (vinblastine) 和长春新碱 (vincristine) 是目前应用最广泛的天然植物抗肿瘤药物之一；蛇根碱 (serpentine) 可用于治疗高血压、 心律不齐等疾病；阿玛碱（ajmalicine）具有镇静作用；长春质碱(catharanthine)具有抗菌止血、利尿、降血糖等作用；其中二岐洼蕾碱(vallesiachotamine) 具有抗肿瘤、抗炎、镇痛等作用，另外其还具有抑制单胺氧化酶A的活性。

目前，大多数长春花生物碱主要是通过从长春花植株中提取得到的，然而这些生物碱在长春花体内的含量极低且化学结构结构复杂，而二岐洼蕾碱在长春花植株内的含量更低，远远不能满足市场的需要。目前，二岐洼蕾碱主要是同过化学合成法获得，但是成本高、环境污染大。利用培养的长春花悬浮细胞的次级代谢产物来合成二岐洼蕾碱，具有成本低、无污染等优点，符合国家关于建设“资源节约型，环境友好型”社会的要求，是一种非常有应用前景的方法。利用植物细胞来生产次级代谢产物主要是采用两步法，即细胞先在生长培养基上培养一段时间，以积累生物量，再转入到生产培养基中促进细胞大量合成次级代谢产物。然而，两步法在工业生产中应用不方便，更换培养基时既费时，又容易造成细胞污染。但是，在长春花悬浮细胞生长的对数后期，通过向培养基中加诱导子的方法，促进次级代谢产物二岐洼蕾碱的合成的一步法，具有操作简便、成本低的优点。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用长春花悬浮细胞来生产二岐洼蕾碱的方法，用茉莉酸甲酯和硫代硫酸银作为混合诱导子加入到长春花悬浮细胞培养液中，使二岐洼蕾碱的含量得到显著的提高。

本发明的方法是在长春花细胞常规培养方法的第12天（细胞生长的对数后期），然后向培养液中加入混合诱导子茉莉酸甲酯和硫代硫酸银，其中，加入硫代硫酸银和茉莉酸甲酯的量分别为25-100 mmol/L（最适量为50 mmol/L）和45-180 μmol/L（最适量为90μmol/L），在25℃条件下继续培养1-7天，所使用的培养基为B5+IAA_0.5+6-BA_1.0培养基。最后采收长春花细胞，提取长春花生物碱，利用HPLC法检测二岐洼蕾碱含量变化。

本发明通过选用适当浓度的茉莉酸甲酯和硫代硫酸银作为混合诱导子，刺激长春花悬浮细胞，使长春花细胞培养物中二岐洼蕾碱的含量得到明显的提高。在加入混合诱导子的实验组中，二岐洼蕾碱的含量达到0.367 mg/g，分别是空白对照组的72.5倍、单独加入硫代硫酸银实验组的31.7倍、单独加入茉莉酸甲酯实验组的3.9倍。本发明操作简便，而且二岐洼蕾碱的含量非常高，适用于工业化生产。

附图说明

图1为培养物提取的HPLC图谱。

图2为50 mM 硫代硫酸银和90 μM 茉莉酸甲酯在单独和混合使用时，对长春花悬浮细胞中二岐洼蕾碱含量的影响。

具体实施方式

实验材料

长春花悬浮细胞培养体系。

培养基的配制

按照常规方法配制得到B5+IAA_0.5+6-BA_1.0培养基。

诱导子的制备

把0.924 g Na₂S₂O₃·5H₂O溶于50 ml无离子水中，再把0.16 g AgNO₃溶于50 ml无离子水中。然后把AgNO₃溶液缓慢地倒入硫代硫酸钠溶液中，一边倾倒，一边迅速搅拌，得到浓度为9.2 μmol/L的硫代硫酸银溶液。称取39.2 mg茉莉酸甲酯，将其溶于10 ml无水乙醇中，得到浓度为0.018μmol/L的茉莉酸甲酯溶液。

培养方法

各实施分别是在B5+IAA_0.5+6-BA_1.0培养基中，光照条件下培养12天，按照不同浓度要求，加入不同含量的诱导子。在25℃条件下，110 r/min，光照条件下继续培养1-7天。从长春花培养物中提取长春花生物碱，通过HPLC法检测生物碱含量的变化。结果分别如图1、图2所示。

从图1中可以看出，在加入诱导子后促进了二岐洼蕾碱含量的增加。从图2中可以看出，与对照组相比，硫代硫酸银的加入能够促进二岐洼蕾碱的合成，其促进作用相对于对照组增加了4倍，且在诱导的第一天，促进作用效果达到最大值，之后随着诱导时间的延长，其促进作用效果逐渐减弱。另外，茉莉酸甲酯在诱导长春花悬浮细胞5天后，二岐洼蕾碱的含量达到最大值，为对照组的19.2倍，之后其促进作用效果有所下降。但是，将茉莉酸甲酯和硫代硫酸银作为混合诱导子使用时，二岐洼蕾碱的含量比单独使用茉莉酸甲酯组有更加显著的提高，从第1天到第5天，随着诱导时间的延长，二岐洼蕾碱的含量迅速增加，在诱导5天后，二岐洼蕾碱的含量达到最大值，为对照组的75.2倍，之后二岐洼蕾碱的含量有所降低。本发明将茉莉酸甲酯和硫代硫酸银作为混合诱导子使用时，比单独使用硫代硫酸银或者茉莉酸甲酯有更加显著的诱导效果，说明茉莉酸甲酯和硫代硫酸银具有协同刺激二岐洼蕾碱合成的作用。

表1长春花悬浮细胞培养基配方

表2 HPLC色谱条件