本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种七带石斑鱼精子稳定、高效超低温冷冻保存的方法。
背景技术：
七带石斑鱼(Epinephelus septemfasciatus)，鲈形目(Perciformes),鲈亚目、鮨科(Serranidae),石斑鱼亚科(Epinephelinae),石斑鱼属(Epinephelus)，俗称：七带斑、石斑、子鱼、真脂、过鱼，主要分布于黄海与东海沿岸，是唯一分布在黄海区域的石斑鱼品种。七带石斑鱼属于大型石斑鱼，具有生长快、耐低温、适应能力强、营养物质丰富、肉质鲜美等优点，深受广大消费者的喜爱，具有较大的经济价值和市场潜力。七带石斑鱼的研究是从2002年开始的，主要集中在人工繁育技术、胚胎发育、肌肉营养、疾病等方面，七带石斑鱼苗种规模化繁育技术和人工养殖方面的研究性工作报道较少。石斑鱼是雌性先熟，雄性后熟并具有性逆转(Sex reversal)特性，雄性亲鱼获得较难，优质精子难以获得，是石斑鱼苗种规模化生产受到限制的一个重要因素。集中批量保存优质七带石斑鱼精液，在需要时解冻进行人工授精获得受精卵，从而克服了七带石斑鱼优质精液供不应求的困难。建立七带石斑鱼精子超低温保存的可靠方法对促进七带石斑鱼苗种规模化培育以及种质资源的保护都具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种七带石斑鱼精子稳定、高效超低温冷冻保存的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种七带石斑鱼精子超低温保存的方法，将七带石斑鱼的精液与抗冻液按体积比5:1-10:1的比例混合，混合后经过一步平衡，三步降温处理后投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、二甲基亚砜(DMSO)、蔗糖三部分组成；
其中，稀释液为NaCl 7.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，Na2HPO4·2H2O 0.1g/L，NaHCO3 0.4g/L；12-15％DMSO(二甲基亚砜)；添加剂：蔗糖30-35g/L。
所述七带石斑鱼的精液与抗冻液在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀10-30s，，在0-4℃平衡0.5-1min，然后以-10--12℃/min降温至-80--100℃，然后以-15--20℃/min降温至-150--160℃，然后以-25--30℃/min降温至-150--180℃后投入到液氮(-196℃)，分装保存。
所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。
所述经抗冻液混合的七带石斑鱼的精液置于0.5ml麦管或者2-5ml的冻存管中。
将经液氮处理分装保存的七带石斑鱼冻精进行解冻，将其直接放入35-37℃水浴100-110s，然后置于室温18-20℃放置至完全融化，而后于自然海水中激活。
载玻片滴入100μL海水，然后加入1-2μL激活后冻精，吸打3-5混匀，随即去3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子数量的比例，经检测冻精相对复苏率高于90％。
本发明具有如下优点：
1.本发明冷冻保存过程中采用DMSO作冻剂，保持较好渗透性的同时DMSO的保护效果作用稳定；
2.本发明抗冻液中加入了蔗糖30.0 g/L作为细胞外部保护剂，对精子的质膜起到很好的保护作用；
3.本发明冷冻保存过程中采用0.5ml麦管，或2-5ml冻存管都获得较好的保存效果，可根据需求选择存贮的容器；
4.本发明技术方案中降温前鲜精与抗冻液震荡混匀10-30s,0-4℃平衡0.5-1min，直接放入程序降温仪中，节省了时间，操作简便易行；同时精子与抗冻液的比例为5:1－10:1比以往1:3－1:1的保存，利于人工授精，同时节约精液；
5.本发明冷冻保存过程以分段降温时，采用以-10℃/min速度降温，-20℃/min，-30℃/min三部降温法，适宜的速度是精子可以充分脱水同时又可使冷冻精子安全度过“危险温度区”，然后投入液氮，整个保存过程不超过15min；冷冻保存降温程序精密，重复性稳定性好，好冻精解冻后复苏率高，激活后相对复活率高于90％，与鲜精活力状态差异不显著；
6.本发明冷冻精子从液氮中取出后，采用35℃-37℃解冻，可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的损伤。
具体实施方式
以下具体实施例用于详细说明本发明，但本发明并非仅限于这些例子。实施例1
1)2013年8月份正值七带石斑鱼生殖生殖期，于莱州东方海洋亲鱼车间，亲鱼养殖车间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得2尾雄鱼的新鲜精液2ml，存于干净的离心管中，避光，显微镜检测活力高于85-90％，置于冰盒中回实验室进行冷冻保存，置于冰盒中进行冷冻保存；
2)抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂、添加剂和蒸馏水组成，配置后置于0℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液为：NaCl 7.5g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，Na2HPO4·2H2O 0.1g/L，NaHCO3 0.35g/L；10％DMSO(二甲基亚砜)；添加剂：蔗糖30g/L。
抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl 7.5g，MgSO4·7H2O 0.1g，Na2HPO4·2H2O 0.1g，NaHCO3 0.35g，蔗糖30g然后定容 至1L备用；然后冻存精液前取88ml稀释液，加入12mlDMSO，即可配置成抗冻保护液使用。
3)将上述鲜精与抗冻液以体积8:1(鲜精：抗冻液)的比例混合，而后在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀20s，分装至0.5ml麦管中，同时程序降温仪开启，预冷至0℃；
4)将冻存管置于降温仪中以-10℃/min降温速率降温至-80℃，然后以-15℃/min降温速率降温至-150℃，然后以-15℃/min降温速率降温至-150℃，将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一顺序放入冻存盒然后放入液氮容器中长期贮存(-196℃)；
5)将上述冷冻保存2周后精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中，然后将冻存管快速从盒中取出放入35-37℃水浴锅中，轻轻摇动100s，然后置于室温18-20℃放置于振荡器震荡30s至完全融解；
6)将上述融解后精液用自然海水激活，激活后取1-2μL冻精滴加在滴有100μL海水的载玻片上，然后吸打3-5混匀，在显微镜检测，经检测冻精相对复苏率高于90％，同时在显微镜随即去3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子数量的比例，在显微镜检测冻精活力80-90％，且80％以上的冻精均作快速的直线运动。
实施例2
1)2014年9月份正值七带石斑鱼生殖期，于莱州东方海洋亲鱼车间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得鲜精。共采集七带石斑鱼3尾，共计鲜精12ml，显微镜检测活力85-90％，置于冰盒中回实验室进行冷冻保存，置于冰盒中进行冷冻保存。
2)抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂、添加剂和蒸馏水组成，配置后置于0℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液为：NaCl 7.5g/L，Na2HPO4·2H2O 0.1g/L，NaHCO3 0.4g/L，15％DMSO(二甲基亚砜)；添加剂：蔗糖30g/L。
抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl 7.5g，Na2HPO4·2H2O 0.1g，NaHCO3 0.4g，蔗糖30g然后定容至1L备用；然后冻存精液前取88ml稀释液，加入12mlDMSO，即可配置成抗冻保护液使用。
3)将上述鲜精与抗冻液以体积8:1(鲜精：抗冻液)的比例混合，而后在碎冰中(0℃)轻轻震荡、充分混匀20s，分装至2ml冻存管中，同时程序降温仪开启，预冷至0℃；
4)将冻存管置于降温仪中以-10℃/min降温速率降温至-80℃，然后以-15℃/min降温速率降温至-150℃，然后以-15℃/min降温速率降温至-150℃，将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫盒中，然后逐一顺序放入冻存盒然后放入液氮容器中长期贮存(-196℃)；
5)将上述冷冻保存1年后精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻， 解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中，然后将冻存管快速从盒中取出放入35-37℃水浴锅中，轻轻摇动100s，然后置于室温18-20℃放置于振荡器震荡30s至完全融解；
6)将上述融解后精液用自然海水激活，激活后取1-2μL冻精滴加在滴有100μL海水的载玻片上，然后吸打3-5混匀，在显微镜检测，随即去3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子数量的比例，在显微镜检测冻精活力80-90％，且80％以上的冻精均作快速的直线运动。