通过血管灌注来导入和除去高浓度的冷冻保护剂的方法与流程

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年7月29日提交的美国临时申请号62/030,205的权益，其全部内容通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及通过冷冻或通过玻璃化保存血管化组织和器官。它涉及器官和组织冷冻保存或存放。它还涉及用冷冻保护作用剂(也称为冷冻保护剂)的组织和器官灌注。本发明是针对组织、器官、甚至整个生物体的冷冻保护剂添加和除去的先前已知方法的改善。

发明背景

本公开涉及通过血管灌注引入和除去高浓度的冷冻保护剂的方法。例如，fahy等人，2009已经使兔肾能够在生命支持的情况下玻璃化和移植，但是此成就受到针对肾髓质中的冰形成的保护不足限制。在一个方面，本申请解决了冷冻保护剂的血管灌注中的这种和其它缺陷。

通常，通过血管灌注引入可玻璃化浓度的冷冻保护剂受到随着浓度升高而增加的粘度限制。逐步升高灌注压以实现更大的流速(fahy等人，2009；美国专利8,679,735b2)已经与兔肾中增加的损伤相关，已被认为增加了从血管床到间质流体的反作用(counterproductive)流体转移的风险，已经显示jiu用冷冻保护剂平衡的功效而言的可变/不一致的结果，并且已经以任意方式完成。本申请解决这些方法和理论问题。

sadri描述了一种灌注装置，其可以在生理条件下允许器官的恒定压力或恒定流灌注(us5,338,662a)。然而，sadri描述了此系统对冷冻保护剂的组织或器官灌注的问题的无应用，并且没有解决本文中所述的任何过程或问题。本申请不是用于装置，而是用于与正常生理灌注无关的方法。

发明概述

本公开涉及灌注方法(在本文中称为flowlock方法)，其特别适合于以下述方式将冷冻保护剂，特别是可玻璃化浓度的冷冻保护剂分布贯穿血管系统，使得在使对作为生物“个体”的每个输注的生物系统的损伤最小化的情况下加速组织与冷冻保护剂的平衡，使得能够遵循可适应具有不同血管阻力的生物系统的标准方案。该方法旨在解决灌注含有冷冻保护剂的高粘度含水灌注液的问题，在动脉灌注液和灌注的组织或器官或器官系统或生物体之间平衡那些冷冻保护剂上没有过度延迟，且不损害灌注的组织、器官、器官系统、或生物体。同时，该方法旨在提供在添加和除去冷冻保护剂期间控制动脉压的方式。

在一个实施方案中，本公开的方法的特征可以在于用于通过血管灌注用冷冻保护剂平衡生物系统(组织、器官、器官系统或生物体)的方法，其包括：

a)对用于所述灌注过程的动脉流速设置(指定)下限；

b)在恒定的第一动脉灌注压下增加动脉灌注液中的冷冻保护剂的浓度，直到所述灌注液的上升粘度引起所述动脉流速下降为变得等于对步骤a)的动脉流速设置的所述下限；

c)在步骤a)的动脉流速的设置下限处将所述动脉流速保持恒定；

d)由于上升的灌注液粘度与步骤a)和c)的动脉流速的恒定下限组合，允许动脉灌注压从步骤b)的第一动脉灌注压升高到等于或低于预设置的最大动脉灌注压的更高压力；然后

e)

i.如果所述动脉灌注压没有达到上述步骤d)的预设置最大动脉灌注压，则继续以步骤a)的动脉流的设置下限灌注所述生物系统，或者，

ii.如果所述动脉灌注压达到上述步骤d)的预设置最大动脉灌注压，则可以根据需要，允许动脉流速下降到上述步骤a)的动脉流的设置下限以下，以将所述动脉灌注压维持于步骤d)的所述预设置最大动脉灌注压。

用于添加和除去冷冻保护剂的增强的安全性的改善的方法

在另一个实施方案中，本公开还提供了用于通过血管灌注用冷冻保护剂平衡生物系统(组织、器官、器官系统或生物体)，然后以增强的安全性除去所述冷冻保护剂的改进的方法，包括关于添加冷冻保护剂描述的方法的所有上述步骤a)-e)，随后：

f)在灌注所述生物系统时，通过开始升高所述动脉灌注液的温度或通过降低所述动脉灌注液的冷冻保护剂浓度，或这两种方式来降低所述动脉灌洗液的粘度，然后；

g)如果所述动脉灌注压在上述步骤d)的所述预设置最大值以下，则继续以上述步骤a)的动脉流速的所述设置下限灌注所述生物系统，直到动脉压力下降到上述步骤b)的所述第一动脉灌注压，此后通过根据完成这点的需要增加所述动脉流速，将所述动脉灌注压维持于上述步骤b)的所述第一动脉灌注压；或者

h)如果所述动脉灌注压等于上述步骤d)的所述预设置最大动脉灌注压，则根据需要增加动脉流以维持此压力，直到下述时间，如所述动脉流速变得等于上述步骤a)的动脉流的所述设置下限，然后将所述动脉流速在上述步骤a)的动脉流的所述设置下限保持恒定，直到所述动脉灌注压降低到变得等于上述步骤b)的所述第一动脉灌注压，此后通过根据完成这点的需要增加所述动脉流速，将所述动脉灌注压维持于上述步骤b)的所述第一动脉灌注压。

用于添加和除去冷冻保护剂的增强的安全性的改善的方法

在另一个实施方案中，本公开还提供了用于通过血管灌注用冷冻保护剂平衡生物系统(组织、器官、器官系统或生物体)，然后以增强的安全性除去所述冷冻保护剂的改进的方法，包括关于添加冷冻保护剂描述的方法的所有上述步骤a)-e)，随后：

f)在灌注所述生物系统时，通过开始升高所述动脉灌注液的温度或通过降低所述动脉灌注液中的冷冻保护剂的浓度，或这两种方式来降低所述动脉灌注液的粘度，然后

g)如果权利要求1的步骤e)结束时的所述动脉灌注压高于预定第二最大动脉灌注压，所述预定第二最大动脉灌注压低于上述步骤d)的所述预设置最大灌注压，但高于上述步骤b)的所述第一动脉灌注压，然后，以足以建立所述预定第二最大动脉灌注压的动脉流速灌注所述生物系统，条件是足以建立所述预定第二最大动脉灌注压的所述动脉流速不超过上述步骤a)的所述设置最小动脉灌注速率；

h)由于在灌注所述生物系统时，通过开始升高所述动脉灌注液的温度或通过降低所述动脉灌注液的冷冻保护剂的浓度，或这两种方式降低所述动脉灌注液的粘度，增加所述动脉流速，使得将所述动脉灌注压维持于所述预定第二最大动脉灌注压；

i)当所述动脉流速变得等于上述步骤a)的所述预设置最小动脉流速时将所述动脉流速保持恒定，直到所述动脉灌注压变得等于上述步骤b)的所述第一动脉灌注压；然后

j)根据需要升高所述动脉灌注压以维持上述步骤b)的所述第一动脉灌注压。

用于添加和冷冻保护剂的加速除去的改善的方法

在另一个实施方案中，本公开还提供了用于通过血管灌注用冷冻保护剂平衡生物系统(组织、器官、器官系统或生物体)，然后快速除去所述冷冻保护剂的改进的方法，包括关于添加冷冻保护剂描述的方法的所有上述步骤a)-e)，随后：

f)在灌注所述生物系统时，通过开始升高所述动脉灌注液的温度或通过降低所述动脉灌注液的冷冻保护剂浓度，或这两种方式来降低所述动脉灌注液的粘度，并且同时

g)将在上述步骤e)结束时存在的所述动脉灌注压维持下述时间，所述时间比所述动脉流速增加到等于或超过上述步骤a)的所述最小设置动脉流速需要的时间更长；然后

h)以在所述时间结束时存在的速率锁定动脉流速，所述时间比所述动脉流速增加到等于或超过上述步骤a)的所述最小动脉流速需要的时间更长，直到所述动脉灌注压下降到上述步骤b)的所述第一动脉灌注压；然后

i)将所述动脉压锁定于上述步骤b)的所述第一动脉灌注压，通过根据必要增加所述动脉流速维持所述动脉灌注压进行。

附图简述

图1显示了在整只兔的情况下添加冷冻保护剂的flowlock方法的原理的应用。

图2显示了如应用于兔肾的flowlock方法的原理。

图3显示了flowlock方法对兔肾尿液输出的影响。

图4显示了在兔肾的情况下尿液输出和尿液浓度之间的全局关系。

图5显示了特定flowlock条件对兔肾的尿液中冷冻保护剂浓度的影响。

图6显示了根据flowlock方法灌注的兔肾的活力，其中使用flowlock方法，其原则上允许肾在以可达到的加热速率加热时从脱玻璃化(devitrification)损伤中逃脱。

发明详述

在一个实施方案中，公开的方法可用于在高粘度冷冻保护剂溶液的引入和除去两者期间控制动脉灌注压，如其总浓度等于或超过4摩尔或其粘度等于或超过约1.25-1.5cp(厘泊)的溶液。在一个实施方案中，公开的方法可用于在粘度增加的时期和粘度降低的时期两者期间促进平衡，例如在渗透性冷冻保护剂浓度升高得高于4m期间和在渗透性冷冻保护剂浓度从高于4m降低至接近或等于4m的最终值期间两者。

在总结本文中公开的方法的一个实施方案中，所述方法当它涉及将冷冻保护剂添加到灌注系统中时包括：a)当粘度增加时，将动脉流锁定在最低水平，并且因此允许动脉压力升高到不超过预设置最大值的压力，以及b)将动脉压保持于不超过预设置最大值的升高水平，直到完成冷冻保护剂添加，在此时间期间允许动脉流，若必要的话避免超过预设置最大动脉压，降低到低于名义最小动脉流，实际流由灌注的生物系统的血管阻力和主导(prevailing)粘度确定(如下面在图2的左侧显示，参见下面的讨论)。

在一个实施方案中，该方法对于许多目的是有用的。例如但不限于，首先，其允许个别灌注系统的天然血管阻力来规定使所述系统与灌注溶质平衡所需要的动脉灌注压，而不是任意施加高于可能损害性的必需压力。第二，特别在肾的情况下，其允许肾确定哪个途径对于平衡是强调的，即血管路径(如果血管阻力低，甚至能够通过血管灌注实现内部髓质冷冻保护剂平衡)或肾小球滤过途径(如果血管阻力更高并且灌注压因此更高，其可以比直小血管的灌注向内髓质递送更多的冷冻保护剂)。第三，该方法具有诊断应用，其涉及了解由于升高的压力引起的流体/冷冻保护剂外渗与由于升高的灌注液粘度引起的血管系统中的流体保留之间的平衡。该方法不是通过使用高灌注压来克服血管阻塞如栓塞(emboli)的方法。

在一个实施方案中，方法当它涉及从生物系统中除去冷冻保护剂时包括额外的步骤：c)降低冷冻保护剂或其它粘性水溶性溶质的动脉浓度，同时将动脉灌注压在预设置最大值处保持恒定，在该时间期间，当粘度下降时，动脉流将上升；d)当已经达到所述流动最小值时，将动脉流锁定于先前的流动最小值，然后当粘度继续下降时，这引起动脉血压降低到低于预设置最大值；并且最终e)当动脉压力下降到视为适于恢复恒定压力灌注的安全水平时，将动脉压力保持恒定，之后动脉流将根据由灌注液粘度和其它因素的进一步下降引起的有效血管阻力的减小而上升。在本文中也描述了这种基本方法的某些变化以处理给定器官的更具体的要求。

这些新颖的且先前未研究的灌注技术首次使灌注的生物系统能够更好地与冷冻保护剂平衡，并且在一个示例性系统兔肾的情况下，保持高水平的活力，如通过移植和通过移植系统的生命支持证实，尽管比先前已知的(美国专利8,679,735b2)方法可实现的更彻底的平衡。这些结果第一次甚至使兔肾与足够的冷冻保护剂平衡，以在从玻璃体或近玻璃体状态的再加热期间逃脱破坏性脱玻璃化水平(冰形成)，同时在移植后保持全部生命支持能力。因此，称为“flowlock”方法的整体方法使器官冷冻保存的问题通常相当接近成功的结果。

在目前的上下文中，术语“可玻璃化的”指示溶液或生物系统可以以适用于灌注的组织和器官的冷却速率，即以20℃/min或更小的冷却速率，更优选在5℃/min或更小的冷却速度。在当前上下文中，“溶液”总是水溶液。冷冻保护剂也称为冷冻保护剂或cpa，并且词语“冷冻保护剂”和“冷冻保护作用剂”可互换使用。冷冻保护剂的性质是本领域公知的，并且国家医学图书馆具有用于“冷冻保护剂”的特定主题类别，其通过引用整体并入本文。举例而言，“冷冻保护剂”可以包括渗透性冷冻保护剂(pcpa)(通常具有小于100道尔顿的分子量并且能够以有用的速率进入细胞)，具体实例是二甲亚砜、乙二醇、甲酰胺、甘油、丙二醇等(对于更完整的列表，还参见karow，1969)，但其还可以包括更新的分子，如多重乙酰化海藻糖，其渗透性已经改变以使得这种通常不可渗透的分子以有用速率进入细胞(参见abazari等人，2015)和非渗透性cpas(npcpa，由分子量大于100道尔顿的冷冻保护剂组成，在其使用条件下不以可观的速率通过细胞膜)。如本文中使用的，术语“冷冻保护剂”是指一种或多种冷冻保护剂，并且指单独的pcpa或pcpa和npcpa的混合物。在本上下文中的“尿液”是指在冷冻保护剂灌注期间从输尿管出现的流体，其是冷冻保护剂溶液的超滤液，并且在概念上或在组成上不带有与普通尿液的相似性。

不需要特定的冷冻保护剂溶液来实施如描述的本公开的方法，所述方法适用于例如使用任何足够无毒的冷冻保护剂溶液。然而，本文中和引用的参考文献中提供了几个实例，并且这些实施例与本领域的普通技术结合足以使得本文中描述的方法能够成功地实施。如上文详细描述的本公开的具体实施例现在通过具体的实施例例示并且结合具体的实施例讨论。

实施例1：仅用于冷冻保护剂加载的flowlock方法

用于将冷冻保护剂添加到灌注的生物系统中的flowlock方法示于图1中。在60mmhg的动脉压下灌注新西兰白兔，期间逐渐导入m22玻璃化溶液(记载于fahy等人，2004和美国专利8,679,735b2)。上小图显示，随着冷冻保护剂浓度增加(在从顶部开始的第四幅小图中显示)，由于冷冻保护剂溶液的粘度增加，动脉流降低。然而，当动脉血浓度达到4m时，将动脉流“锁定”于当时(then-prevailing)的值。这引起动脉压从60mmhg增加到最终110mmhg(从顶部开始的第二幅小图)，然而，尽管压力增加了83％，兔重量增加了小于7％。

虽然不希望受任何理论束缚，但是该方案背后的想法是，提高血管阻力的相同粘度增加也会减缓血管流体从血管系统到间质的渗出，使得不必缩减流速以补偿增加的粘度。兔在夹紧或“锁定”流动期期间不能增加可观的重量支持这种猜想并验证该方法。此外，因为兔由大量不同的器官和组织系统组成，所以实验提供了对于所有灌注的器官和组织以及多器官系统和整个生物体的flowlock方法的适用性的支持。

flowlock冷冻保护剂添加(“加载”)方法除了维持流动并因此维持冷冻保护剂到灌注的生物系统的递送之外还具有许多优点。首先，其使得灌注系统而不是方法用户能够确定发生的压力增加概况：这仅仅是灌注的生物系统的固有表观血管阻力(粘度未校正的血管阻力)的结果，这意味着压力概况基于系统与系统的内在差异而个体化。这消除了猜测任意想象的理想压力或一系列压力以及猜测在压力的步骤变化(stepchange)的适当时机的需要。此外，flowlock方法以平滑且连续的方式改变压力，而先前已知的方法采用压力的突然变化，其可能对于精细的血管结构是不必要地有压力的，特别是在如图1的最低小图中所示的低温下，以及在fahy等人2004和fahy等人2009中甚至更极端的例子中，其中器官在冷到约-22℃的温度下灌注，在该温度下组织和细胞可能是脆性的，并且容易被机械应力例如突然拉伸损坏。

由于用于冷冻保护剂分布到灌注的器官或组织中的速率限制因素通常可以是冷冻保护剂动脉供应到感兴趣的特定器官或组织中的流速，选择先前已确定对于所述系统安全的流速并且在冷冻保护剂引入的大部分或全部过程中维持它的能力有助于克服通过血管灌注冷冻保护组织或器官的主要障碍。此外，选择压力偏移上限的能力允许容易地控制和调查由flowlock方法引起的损坏。而不是必须分析更复杂的方案的影响，压力上限可以简单地通过实验调整，以确定什么对目前的系统类型是最佳的。

发现如在整个兔模型中评价的flowlock方法使得当取样42份不同的器官和组织时，每个组织的冰的平均质量百分比低至0.75％w/w，并且通过差示扫描量热法测试冰数量，所述冰在先前冷却至低于玻璃转变温度，然后缓慢再加热之后融解(fahy等人，未发表的结果)。给定组织中0.75％w/w冰的水平可与其在再加热后的存活相容(fahy等人，2009)。在全兔模型中测试的最佳flowlock系列中，超过80％的所有取样的组织根本不显示冰形成(fahy等人，未发表的结果)。这再次支持flowlock方法对于所有组织和器官的适用性的普遍性，所述组织和器官在用于治疗应用或实验研究的存放(banking)背景下可能感兴趣的。

实施例2：用于冷冻保护剂添加和除去的flowlock方法

图2显示了在冷冻保护剂灌注之前具有非常不同的血管阻力值的两种不同兔肾(实验1(左)和2(右))的不同响应。基本灌注方案如先前已知的方法中所述(fahy等人，2004,2009；美国专利8,679,735b2)，但是flowlock方法叠加在其上，用于冷冻保护剂的加载(添加)和卸载(移除)两者。

在我们实验室中使用的标准方法(不需要遵循所述方法来实施flowlock方法)中，将冷冻保护剂缓慢添加到第一中间浓度(在这种情况下为5m冷冻保护剂)，然后存在有暂停，以允许在此相对安全的第一中间浓度的冷冻保护剂摄取的时间。接着的步骤是跳到接近8m的第二中间浓度，并将此浓度维持足够长的时间，以使器官能够在不冷冻的情况下冷却至约22℃。然后，通过降低动脉灌注液的温度将器官冷却至约-22℃(在图2中由垂直线指示)，冷却过程需要约10分钟。接着的步骤是跳到最终浓度(在这种情况下，称为m22的玻璃化溶液，在所述先前已知的方法中描述，其浓度为约9.4m)，并维持该峰浓度至少20分钟以使肾为可玻璃化的并且在再加热期间足够稳定以防止冰形成。在m22步骤之后，降低动脉灌注液的浓度，通常回到与第二中间浓度相同的水平，然后，在暂停后，第二次将浓度突然降低，通常回到第一中间浓度。图描绘了仅从加载期间的第一中间浓度的阶段到在冷冻保护剂卸载(冲洗)期间的第一中间浓度的灌注方案。

在过去，已经与压力的各种步骤变化(特别是在m22灌注开始的时刻和在已经编程m22灌注为停止的时刻)组合研究了该基线方案。然而，它从未与冷冻保护剂添加或清除或两者期间灌注压的逐渐和连续变化组合研究，它从未与不与具有冷冻保护剂的峰浓度的灌注的开始和结束同时的压力变化组合研究，并且它尚未与仅由于保持流动常数而改变压力的任何方法组合研究。

表示如图2中显示的flowlock方法的起程在冷却到-22℃开始之后不久开始。如在冷却开始时由垂直线突出显示的，冷却导致粘度急剧增加，并且因此引起灌注液流动的急剧下降(最低小图)。在左边显示的实验中，在冷却到-22℃开始时的肾流速已经较低(小于0.4(ml/min)/克)，并且冷却迅速将其再降低两倍，但是在那点时，通过足以将流速锁定于0.2(ml/min)/克的灌注压的稳定升高来防止流动的进一步减少。压力平滑且逐渐上升至最大允许值80mmhg，在该点处将压力维持恒定，并且允许流动下降至较低值。与动脉浓度降低以及与从-22℃至-3℃的恢复一致，灌注液粘度降低，导致在先前建立的恒定压力下的流速的增加。在将流动返回到先前的最小值或“锁定”值时，流动再次保持恒定，以使动脉压力平滑、连续、并且逐渐下降回到40mmhg的高温、低粘度灌注的基线安全压力。一旦压力降至标准40mmhg，将其再次锁定于40mmhg，然后当灌注液粘度进一步降低时，流动自然增加。与先前已知方法的快得多的变化相比，与flowlock方法的加载和卸载阶段两者相关的压力变化需要几分钟完成，这是可以减少对灌注器官的损害的因素。

相同的方法也应用于右侧中描绘的实验中，但是在这种情况下，在冷却至-22℃开始时，肾的流速高约50％。因此，如左侧显示的将流动锁定于相同的0.2(ml/min)/g值仅仅导致灌注压的相对小的增加，其绝不接近左侧显示的实验的80mmhg限度，并且这使得流动能够在无危害的情况下维持于靶标0.2(ml/min)/克。由于这点，灌注在右侧显示的肾具有更好的灌注，具有最高浓度的冷冻保护剂，但是灌注在左侧描绘的肾比它将在恒定压力方案下有效得多地得到灌注，使得它比它在其它情况下的情况与实验2肾可比得多，并且另外受益于肾小球滤过的补偿增加，这允许它在一定程度上抵消其较低灌注率的相关后果，如在下一段中解释。还要注意，压力变化率对于右侧肾比对左侧肾低得多，例示了尽管用flowlock方法的压力变化率必然总是小于对于先前已知的突然步骤方法，它们也将取决于特定的灌注系统。幸运的是，不需要规定这些速率来实施本公开，因为在不考虑压力变化率的情况下进行本公开的过程。

通过玻璃化冷冻保存肾的限制因素是由于玻璃化之前不能将冷冻保护剂分配得与到肾的剩余部分一样有效到内髓质引起的内髓质的脱玻璃化(在再加热期间形成冰)。在肾的情况下，内髓质在体内接收总肾血流的约1-2％，但它接收100％的非再吸收的血浆超滤液，并且事实上，此血浆超滤液流过内髓质三次数，一次通过亨利袢(loopofhenle)的降支，一次通过亨利袢的升支，并且当它们从皮质下降到乳突到骨盆时，一次通过集合管。因此，肾是一种重要的特殊情况，其中flowlock方法是特别有利的，因为它通过提高动脉压增加肾小球滤过和冷冻保护剂对内髓质的递送来补偿低灌注率，特别是在内髓质中，在那里它们是最关键的。然而，它没有不必要地提高下述肾的灌注压，所述肾倾向于通过直接血管途径递送更多的冷冻保护剂，因此可能不同样需要通过肾小球过滤途径的平衡。

在flowlock方法的变型中，可以锁定组织/器官流速，而对最大压力没有明确限制。在这种情况下，通过将流动锁定于不足以导致压力的损害性增加的水平来防止损坏。这在图2的右小图中显示了此构思，其中对压力建立上限是不重要的。然而，其可以同样良好地应用于图2的左图中显示的情况，其中由于流动保持恒定，压力限制的缺乏已经允许压力上升到远高于80mmhg，但是其中较高的动脉压可能仍然是可容忍的。例如，实施flowlock方法已经指示，例如，90mmhg的上限压力不比80mmhg具有更大的损害，而在涉及突然的压力变化的先前已知的方法中，由于压力在50-90mmhg的范围内升高(fahy，未发表的观察结果)，存在着损伤以稳定的方式随着压力增加的趋势。在实践中，在安全动脉灌注压上将总有一些上限，但是flowlock方法将是有效的，只要灌注的组织或器官或器官系统在等于或低于该上限的压力下灌注，无论已知和规定上限与否。然而，为了安全性和一致性，应当优选设置不应超过的实际压力上限。通常，flowlock方法的上限压力范围可以为约5mmhg至130mmhg，这取决于所讨论的系统的尺寸和血管阻力(例如，对于肝脏或对于肺，5-10或5-15mmhg，以及对于生物体为50-130mmhg)或更通常为10-100mmhg。

为了与先前描述的方法进行比较，图2的实例显示在这两种极端情况中，压力变化都不与m22(峰值浓度)灌注的开始或结束一致。在左小图中，压力变化的开始与m22灌注的开始和结束之间的错配是如此极端，以致对于肉眼而言是容易明显的，并且不需要此错配的突出显示。在右小图中，长虚线垂直线表示压力变化的开始在计算机转换成m22开始后约5分钟，而与粘度降低相关的压力变化的开始(由短虚线垂直线标记)适当地在m22冲洗的开始之前约2分钟，这是由于肾的先前的再加热，及其伴随的粘度降低以及灌注液流动的所得增加。

相比之下，在先前的方法(美国专利8,679,735b2)中，“可以在第一压力下进行压力…然后灌注所述可玻璃化浓度的冷冻保护剂，并可升至第二压力…当用所述溶液灌注开始时”(第10栏，第16-21行，加强调)。此方法不同于连续压力升高，其源自锁定器官流速和对灌注系统本身的固有血管阻力的压力的自然效应，不依赖于特定可玻璃化溶液的灌注的开始。此外，在描述‘735说明书的图10中，所述说明书记录，“m22灌注期间动脉灌注压对用冷冻保护剂的组织平衡的影响”(第8栏，第4-6行)通过以下方法测定：“在所有情况下，…在用m22灌注之前动脉灌注压为40mmhg，并且压力设置为在m22灌注开始时绘制的所述值”(第8栏，第7-11行，加强调)，而不是由恒定流速和灌注肾的血管阻力的组合控制。此外，根据‘735的表4的数据和在‘735中关于它的附随注释，在高于60mmhg的压力下灌注对组织平衡起反作用，这可能是由于压力到高于60mmhg的压力和从高于60mmhg的压力起的步骤变化引起的损伤，而在本公开中，当压力在60和90mmhg之间变化时，我们观察到平衡没有问题，可能由于本公开中更温和的改变压力的方法。这代表了使用更高压力驱动冷冻保护剂平衡的能力的基本进步，这对于血管化组织、器官、器官系统和潜在生物体的成功存放是至关重要的。

在相同的先前已知的方法(‘735)中，在冷冻保护剂的峰值浓度的冲洗期间，“在冷冻保护剂稀释开始时、期间或之后的灌注压可以降低到低于下述压力，该压力低于在低于-10℃的灌注期间使用的压力”(第10栏，第52-54行，加强调)，但这并不考虑在冷冻保护剂稀释之前降低压力，如图2的右小图中显示，并且不考虑：容许压力由于在冲洗期间将流动锁定于恒定数值并且根据灌注系统的血管阻力连续且平滑降低，而不是在一步中突然到预设置压力。在先前已知的方法中没有任何内容提示应当通过锁定灌注率降低压力，并且在正常技术中，通过降低而不是锁定动脉流速降低压力，这导致突然的压力降低，基于本公开中的对较高压力的容忍，其可能是损害性的。

在‘735中仅显示了改变压力的过程的一个实例，并且那是在实施例6(图11)中，其中非常清楚的是，压力增加和降低是突然的，并且与恒定流灌注的任何使用或灌注器官的血管阻力或灌注液的粘度的任何效应无关，并且除了压力的这些突然步骤变化外，压力总是保持恒定。这对于解释‘735权利要求7-9、11、29和33的意义是重要的，所有这些都规定了在叙述的范围内从一种压力突然转变到另一种压力的压力目标范围，但是无一规定在这些范围内的压力的逐渐变化或由于面对改变粘度而施加恒定流条件所致的在这些范围内的压力的逐渐变化，如由本公开的性质需要的。此外，权利要求7-9、11、29和33受‘735说明书的权利要求1的特征限制，并且那些限制不需要应用于本发明的情况(例如，参见实施例1)。

总之，实现在冷冻保护剂添加和冷冻保护剂冲洗两者期间的压力变化的本原理和方法不是由先前描述的方法涵盖的并且相对于先前描述的方法是新颖的。

实施例3：flowlock方法改进了冷冻保护剂灌注期间的尿液输出

图3显示了用于在根据图2中显示的方案用美国专利8,679,735b2中描述的“m22”玻璃化溶液灌注兔肾期间增加尿液输出的flowlock方法的功效。与标准方法中一样，首先在-3℃灌注第二中间浓度(“第二平台”浓度)以使肾准备冷却至-22℃，然后在-22℃灌注以冷却肾，准备以峰值浓度灌注，并且这些灌注阶段在图中表示并且由垂直线界定。

在fahy等人(2004)描述的标准(恒压)方法中，通过泵连续回收并且每5分钟转移到用于定量的刻度量筒的累积尿液产生在用m22灌注开始时达到约0.3ml/克，然后由于较大的粘度和降低的流速而减缓，到标准的20分钟m22灌注期结束达到约0.4ml/g(基线方法，10次灌注)。通过将流动锁定于名义0.2(ml/min)/g，如图2中显示，尿液输出从基线方法输出到初始-22℃灌注期逐渐偏离。随着m22灌注开始，在先前已知的方法中看到的尿液输出减缓是迟钝的，导致在flowlock灌注与先前已知的灌注中看到的尿液产生之间的增加的分离。在flowlock1(fl1)中，压力限制为最大值90mmhg，并且在flowlock2(fl2)中，压力限制为80mmhg，但是几个肾没有达到这些限制之任一，并且在flowlock1和flowlock2之间的尿液产生总体上有很少的差异，因此在图3中合并了结果。[如上所述，从移植后血清肌酐曲线(数据未显示)判断，达到90mmhg的肾和达到80mmhg的肾之间的存活力没有差异]。fl1-2干预使m22灌注结束时的尿液输出提高至约0.6ml/g，这相对于基线方法改善约50％。flowlock3(fl3)方案与fl2相同，只是m22灌注时间从20分钟延长至25分钟。这导致约0.05ml/g的进一步增加，或相对于基线另外12％的改善。将流动限制设置为0.3(ml/min)/g，同时保持fl3的其它特征相同(fl4方案)在灌注25分钟后使尿液输出再增加约0.06ml/g，相对于基线的总计增加为约78％。

在将流动锁定于几乎0.5(ml/min)/g之后获得了肾的良好存活，因此在flowlock方法中的锁定流动的实际上限(至少适用于具有强烈浓缩且非常粘的(在室温下约4.34-4.83cp，在-22℃下约38.7cp)m22溶液的灌注的极端情况)为约0.3-0.5(ml/min)/g。对于与浓缩得低得多且粘度较低的溶液一起使用，预期将肾流动锁定于0.5(ml/min)/g，甚至更高的流动，例如0.6、0.7、甚至0.8(ml/min)/g将是可接受且有效的。

然而，由于肾接受不成比例的总心输出量，并且在冷冻保护剂引入之前具有约0.8-1.2(ml/min)/克的名义流速(其比对于大多数其它器官更高)，对于其它器官需要看待这些限制。因此，以百分比表示，0.1-0.8(ml/min)/克的限度等于初始(在引入冷冻保护剂之前)流动的8-100％的限度，或更通常用于用可玻璃化浓度的冷冻保护剂灌注，0.2-0.4(ml/min)/克等于(0.2/1.2-0.4/0.8)x100＝16-50％初始流动，并且0.2-0.3(ml/min)/克等于16-38％初始流动。大多数器官(包括肾)的良好工作平均百分比为初始流动的25％，或更通常为初始流动的15％至40％。因此，flowlock方法可以通过使用根据上文显示的实施例的所有器官的固定流速标准或在用冷冻保护剂灌注之前器官的流速的固定百分比的流速来应用。对于灌注树脂(其比冷冻保护剂溶液粘度高得多)、通过用于电子显微术的固定组织，或对于灌注其它粘性水溶性溶质(树脂或其他粘性水溶性溶质灌注前在1-20％流速范围内的固定流速)可能是优选的，尽管固定材料可以耐受更高的灌注压。

实施例4：flowlock方法提高了尿液冷冻保护剂浓度

图4显示，随着尿液体积相对于灌注肾的质量增加，如通过flowlock方法诱导，尿液浓度存在相应的增加。绘制的线指示在最差的平衡肾(下线)和最佳平衡的肾(上线)两者中存在响应，其间的肾以与低和高极限的肾类似的方式响应。认为上线和下线之间的差异是源自不同的初始流速和肾与肾的血管阻力值，即来自可发生肾髓质平衡的第二竞争途径中的肾之间的差异(血管灌注，这也由flowlock方法促进)。

图5显示了与图3相同形式的结果。如图3中描述的尿液体积曲线与基线(恒定压力)fahy等人(2004)方法中所见的曲线的偏离仅在20分钟m22灌注期的最后5分钟期间开始与增加的尿液浓度强烈相关。虽然锁定流动对尿液浓度的影响在这之前是可见的，但它变得显著，并且在该测试系统中仅在15分钟后就得到放大。在20和25分钟之间的尿液浓度的增加几乎与存在有0和20分钟之间的m22灌注一样多。

我们解释此结果以指示肾单位像含有一定体积的管道，所述体积在可以在管道末端检出新滤液的存在之前必须被所述新滤液替换。尽管体积流动增加，但是出现的体积保持稀释，直到更浓的冷冻保护剂的波前开始出现。因此，到m22灌注的约10分钟，通过过渡的约7.9m溶液对肾单位中的原始5m溶液的置换接近完成，但是先前10分钟引入肾动脉中的m22尚未开始从输尿管出现。再过5分钟后，m22开始出现，并持续到25分钟时间点。flowlock方法的效用似乎部分源自“管道”流体置换的过程比先前已知的方法更早地开始，并且部分源自更快地推动冷冻保护剂通过肾单位“管道”，从而允许更浓的冷冻保护剂的波前更早地从肾单位和输尿管出现，之后在肾(特别是皮层)的高流动、快速平衡区域中经历限制性毒性。

图5的关键特征在于，对于flowlock3和flowlock4方案，最终尿液浓度接近8.64-8.8m(由水平虚线指示)或更高的区域或在8.64-8.8m(由水平虚线指示)或更高的区域中。此结果的意义是可以玻璃化和再加热尿液浓度达到这些值的肾，而不在从玻璃化状态再加热期间将超过1％的其内髓质量转化为冰。认为将内髓冰含量限制于小于或等于1％与内髓的存活和移植后正常肾功能的恢复相容。使用先前已知的技术(fahy等人，2009)的先前玻璃化和移植的肾的存活在m22灌注期间采用相似的最终压力水平80mmhg，但是在内髓中没有实现小于1％的冰形成，并且在移植后48天检查肾时肾髓质损伤在组织学上是明显的，可能是由于这种过多的内部髓质冰形成所致。认为，移植后对该肾所见的肾功能的慢性损伤也至少部分是由于先前的内部髓质冰损伤所致。因此，flowlock方法相对于先前已知的方法而言是一项重大的技术进步，所述flowlock方法能够实现更多的内部髓质冷冻保护剂平衡，在从玻璃化状态(脱玻璃化)再加热后更少的冰形成，以及在较高压力下的m22灌注之后存活力的更好保留。

最佳方法是在一方面来自较高锁定流和较高灌注压的损伤与另一方面来自较长暴露时间的损害之间的折衷。对于兔肾，我们认为最好的折衷是使用0.1-0.25(ml/min)/g的最小流速、20-30分钟的峰值浓度灌注持续时间和70-100mmhg的压力上限。表示为冷冻保护剂前流速的百分比，该流速范围包括冷冻保护剂前流速的8-31％。

实施例5：flowlock方法可以使肾在移植后保留其存活力的情况下对脱玻璃化免疫

图6显示了多只兔在它们接受根据flowlock方法用m22灌注的肾后14天的最终术后血清肌酐水平。这些肾都达到下述那些浓度或高于那些浓度的范围中的尿液浓度，所述浓度允许玻璃化而没有随后的脱玻璃化(在先前玻璃化后高于玻璃转变温度的再加热后形成冰)。该图绘制了最终血清肌酐水平与在m22灌注的预期期间结束时实现的尿液浓度，此时肾已经从灌注设备中取出并且玻璃化(如果玻璃化已经成为实验的目的)。相反，显示的实验的目的是评估用足够的冷冻保护剂进行肾平衡以防止脱玻璃化(如果已经尝试玻璃化)的效果。如图中指示，为了可靠且一致地逃脱在脱玻璃化期间超过1％w/w内髓质冰的形成，在m22灌注结束时尿液浓度低于8.64-8.65m的肾需要在大于80℃/分钟的速率下加热通过用于脱玻璃化的临界温度区域。如果加热速率为40-80℃/min，则在m22灌注结束时尿液浓度为8.64-8.8m的肾可以可靠加热，具有来自脱玻璃化的<1％w/w内髓质冰。在m22灌注结束时尿液浓度超过8.8m的肾原则上可以以仅10-40℃/min的加热速率玻璃化和再加热，并仍然逃脱形成超过1％w/w的内髓质冰。然而，如在用m22平衡到所有三个这些临界饱和度的肾受体的2周内血清肌酐水平恢复正常所指示，flowlock方法允许许多肾变得对损伤程度的冰形成免疫，并且在移植后仍然完全恢复。

因此，flowlock方法代表了先前已知方法的突破，并且第一次打开了通过玻璃化的常规成功肾存放的可能性的大门。还应注意，所有兔接受直接对侧肾切除术，意味着m22灌注的肾是从其移植的当天的唯一肾支持。

另外，如图6中显示，在肾功能完全恢复的潜力(通过移植14天后的血清肌酐水平测量)和冷冻保护剂的最终尿液浓度之间没有看到明显的趋势。此外，当通过峰值肌酸酐水平或通过在所描绘的不同平衡区内的受体存活的总体概率测量肾损伤时，发现趋势的相同缺乏。显著地，在8.64m-8.8m尿液冷冻保护剂区域中移植肾后的平均峰值血清肌酐水平为约9.5mg/dl，而尿液浓度超过8.8m的肾的平均峰值肌酸酐水平为9mg/dl，并且用先前已知的方法在40mmhg的恒定压力下灌注的肾的平均峰值肌酸酐水平也为约9mg/dl(fahy等人，2004)，尽管事实上先前已知的方法给出低得多的尿冷冻保护剂浓度，这完全不适于玻璃化。因此，与所有先前已知的方法相反，如果实施正确，则flowlock方法大大改善了针对脱玻璃化的肾保护，而自身不引起损伤。

目前有多种较新的电磁加热方法，其应该能够在对脱玻璃化的最大易感性的温度范围内以至少80-160℃/min的速率加热以前玻璃化的兔肾和较大的肾以及其它大器官。因此，图6中提到的基准加热速率实际上是有意义的且可实现的。

实施例6：为灌注压上限设置两个不同的值

可能在至少一些情况下，在所引用的技术中描述的单独或组合的再加热/冷冻保护剂稀释程序期间，从-22℃或特别是从低于-22℃的温度加热的器官可能需要不太有力的灌注。由于所述原因，预期对于在所述再加热和/或浓度降低步骤期间对较高灌注压或流速敏感的系统，可以在那些步骤期间采用低于第一上限的对动脉压的第二上限。通常，预期对动脉灌注压的此第二上限应理想地在不存在冷冻保护剂的情况下的标准动脉灌注压和对动脉灌注压的第一上限之间的大约一半。例如，如果标准动脉灌注压是40mmhg并且对动脉灌注压的第一上限是80mmhg，则对动脉灌注压的第二上限应当是60mmhg左右。因为系统将在其需要上变化，所以对动脉灌注压的第二上限可以是在标准动脉灌注压和对动脉灌注压的第一上限之间的任何地方，但是可以预期，对动脉灌注压的第二上限的最有利的范围通常将从标准动脉灌注压加上标准动脉灌注压和对动脉灌注压的第一上限之间的差的20％到标准动脉灌注压加上标准动脉灌注压和对动脉灌注压的第一上限之间的差的80％。因此，如果标准压力为40mmhg并且第一压力上限为80mmhg，则第二压力上限的理想范围将为(40+40x0.2)至(40+40x0.8)＝48-72mmhg。

存在有可以应用第二上动脉灌注压限制的两种情况。在第一种中，系统已经与灌注机断开以便冷却到低于-22℃和再加热，并且在第二上动脉灌注压下再灌注。如果在将系统与灌注机断开之前的压力等于或低于第二上动脉灌注压，则预定的第二上动脉灌注压的存在是无实际意义的。在第二种情况下，动脉灌注压超过第二上动脉灌注压。在这两种适用的情况下，在第二上动脉灌注压下灌注系统需要动脉流速低于设置的最小动脉流速。因此，在这两种情况下，通过调节流动以建立等同于此新的压力上限的压力，在第二动脉灌注压上限灌注系统。当粘度由于升高的温度和/或降低的动脉灌注液浓度而下降时，增加流动以维持第二动脉灌注压上限，直到流动等于设置的最小动脉流动，此后动脉流保持恒定，直到压力下降到标准冷冻保护剂前灌注压。此后，根据必要增加流动以保持后一标准压力。

实施例6的方法可以特别用于器官，如肝(其具有非常脆弱和精细的血管系统)，或者肺(其具有在较高灌注压下形成肺水肿的趋势)。它还可以用于先前已经玻璃化或以其它方式冷冻保存的生物系统，其血管系统可能比非玻璃化或非冷冻保存的生物系统更容易被较高的灌注压损伤。

实施例7：加速冲洗方案

最终的变化是针对器官，所述器官可以容忍在除去冷冻保护剂期间对较高灌注压和对在血管壁处的较高剪切速率的更为延长的暴露。对于这些器官，如上所述进行冷冻保护剂施用，但是当开始除去冷冻保护剂时，使用修改的方案。在此修改的方案中，将在冷冻保护剂加载过程结束时存在的动脉灌注压维持一段时间，该时间比动脉流速增加到等于或超过最小设置动脉流速需要的时间更长，导致在冷冻保护剂冲洗期间比在上文描述的其他方法中更快的灌注速率。作为一个可能的非限制性实例，在图2中描绘的方案中，可以维持m22平台期结束时存在的动脉压，直到第一m22冷冻保护剂后平台期结束(即，在开始冷冻保护剂冲洗之后10分钟)，或直到第二m22冷冻保护剂后平台期结束(即，在开始冷冻保护剂冲洗后20分钟)，在此时间期间动脉流速将大大增加，而不是将流动锁定于最小设置动脉流速，直到动脉灌注压下降到标准动脉灌注压。(在图2中，实验1中，在m22灌注结束后高压维持约10分钟，因为直到那时，动脉流动低于设置的最小流动，并且肾在此实验和类似的实验中存活。实施例7延伸此情况到即使当动脉流超过设置的最小流动时也维持较高的压力)。在延长的高压冲洗期结束时，然后以当时的速率锁定流动，直到动脉灌注压下降到标准动脉灌注压，之后将压力锁定于标准动脉灌注压，并且允许流动根据必要增加以维持该动脉灌注压。延长的高压冲洗期的最小有益持续时间通常为1分钟或更长。

实施例7的方法部分基于实施例4中描述的“管道”类推。已经观察到(fahy，未发表的观察)，当灌注的m22期结束时，m22溶质的尿液浓度继续上升几个分钟，甚至当动脉浓度迅速下降时。再一次，稀的冷冻保护剂的波前需要有限的时间来置换先前递送的更浓缩的冷冻保护剂，包括下述更浓缩的冷冻保护剂，其可以在有意的m22灌注期间观察到，因为其未能肾单位出现，其中在观察期内仍然含有它。据推测，在m22灌注结束时对肾的损伤不依赖于尿液浓度的一个原因是损伤更依赖于在正式m22灌注期完成后几分钟在肾单位内的m22浓度，在该时间时肾单位浓度达到峰值，就在下降之前。在此推理的基础上，将有利的是，通过维持较高的肾小球滤过以及较高的血管流速，从而加速“尿液”流动，在意图的m22灌注期之后加速肾单位内的高冷冻保护剂浓度的置换。

实施例7的方法的第二种有益效果是通过以较高的速率锁定流动，预期动脉灌注压在锁定流速之后比在flowlock冲洗方法的其它变型中以更低(更温和)速率下降到标准动脉灌注压。

实施例8：flowlock方法的边界和界限

待冷冻保护或玻璃化的生物系统的有价值流速的范围取决于所讨论的系统。例如，在实施例1中，约0.04-0.05(ml/min)/g(冷冻保护剂前流速的约50％)级的全局流速对于取样的80％的组织和器官是合适且足够的，而在实施例2(涉及更快速流动的肾)中，发现约0.1-0.3(ml/min)/g(冷冻保护剂前流速的约10-30％)的流动是最有效的。发现直至刚刚低于0.5(ml/min)/g(在该特定情况下冷冻保护剂前流速的约50％)的最小锁定流动与灌注的兔肾的完全恢复，但与更多的瞬时损伤和可能更低的存活率相容。基于这些结果，适用于flowlock方法的锁定流动阶段的流速范围应限于约0.04-0.5(ml/min)/g，或为了更大的安全性，限于约0.04-0.4(ml/min)/g或当粘度正常时(即，当不存在冷冻保护剂时)正常的流速的约10％-50％，特别是当用下述溶液灌注组织或器官时，所述溶液具有在室温时4-5cp的范围或在-20和-24℃之间30-45cp的范围中的粘度。对于在室温下具有约1.2-2cp的粘度的少得相当多的粘性的溶液，锁定的流动可以更高，如对于整个生物体高达0.1(ml/min)/g，并且对于高流动器官如肾高达0.6-0.8(ml/min)/g，或者一般地，冷冻保护剂前流速的约50％-100％。这两种粘度方案之间的流动上限应根据粘度和血管阻力进行缩放，以保持压力在下文规定的限度内。

flowlock方法的有价值的压力上限的范围取决于待冷冻保护或玻璃化的系统，不同的系统在不同的实验条件下对高压具有不同的耐受性。器官，如肝(通常在门静脉压力接近5mmhg时灌注)或肺(其肺动脉压力通常必须保持在8mmhg或以下以避免肺水肿)需要与诸如肾(其可以容忍80-90mmhg或更高)的器官不同地处理。因此，一般来说，flowlock方法在灌注峰值浓度的冷冻保护剂期间不应产生下述压力，所述压力超过体内压力或者通常在体内由目前的器官或器官系统经历的压力限度。这些正常压力是本领域技术人员公知的。此外，flowlock方法产生的压力不仅取决于锁定流动，而且还取决于灌注液的粘度。基于此，当要使用低粘度灌注液时，期望限制压力小于由给定器官或器官系统在体内通常经历的压力。通常，对于大多数器官，包括肾和心脏，优选80-130mmhg及以下的峰值动脉压力，对于非固定的脑，优选50-90mmhg的峰值压力，并且对于肝和肺，优选峰值动脉压力5-15，或更优选5-10mmhg。如图2中显示，虽然可以设置上限，但是较低的压力当然是可接受的，甚至在它们能够在感兴趣的过程中实现足够快速且完全的冷冻保护剂平衡的情况下更加优选。不要求实际上遇到压力上限。

通常，希望使用下述最大流动，发现所述最大流动对于目前的灌注的生物系统是可接受的，并且发现不产生高于所述系统可接受的压力(压力上限)的压力。考虑到由本说明书提供的指导，凭借经验，本领域技术人员将总是能够在少量实验中确定特定系统的可行性或物理完整性的合适的压力限制。

用冷冻保护剂灌注的持续时间也将取决于保存的生物系统。基于当前信息，在某些情况下可能需要在峰浓度下长达30-60分钟的灌注，而在其他情况下，更短的灌注时间将是足够的。一般来说，对于最佳结果，峰值浓度的灌注时间预期在10-60分钟的范围内，并且对于大多数系统，最理想的范围预期为10-30分钟。

在实施例7的方法中冷冻保护剂冲洗开始后，动脉灌注峰值压力的持续维持持续时间通常为1-30分钟，或者更通常为1-20分钟。

因为本发明是取决于粘度、相对流速和限制压力而不是取决于粘度如何改变(即不取决于特定的冷冻保护剂制剂浓度和温度之间的相互作用，以及不取决于使用任何特定的冷冻保护剂溶液或溶液)的方法，在冷冻保护剂浓度或灌注温度上没有特定的边界和界限。例如，与其它pcpa相比，聚乙酰化海藻糖在非常低的浓度下可以是非常粘的，甚至比在图2中的描述高得多的温度，例如甚至在室温，但是对于成功实施本公开而言最重要的是流动和压力以及它们的相互作用保持在本文中所述的过程限度内，并且温度保持在与生命相容的温度范围内，并且足够温暖以允许灌注继续(即37℃至-40℃)。然而，预期当应用于在4-11m范围内的“普通”pcpa(pcpa<100da的分子量)灌注时，flowlock方法将是最有用的。

引用的出版物/专利，所有这些通过引用整体并入本文：

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(开放源出版物：www.landesbioscience.com/journals/organogenesis/article/9974).

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uspatentpublicationus5,338,662a:organperfusiondevice(lapsed),fereydoonsadri

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