本发明属于植物学领域，更具体地，本发明涉及一种芍药属木本植物离体对活体嫁接的方法。
背景技术：
牡丹(paeoniasufruticosa)，别名富贵花、百两金、木芍药、鼠姑、鹿韭，洛阳花，为芍药科芍药属木本植物，落叶灌木。该物种亦花(观赏)亦药(丹皮)，浑身是宝，具有重要的研究意义。2015年，牡丹被列为国家十三五拟拓展的转基因物种之一。
然而，牡丹离体快繁或转基因的抗性芽生根频率低下，而且根的质量不好，土壤移栽不能存活。因此，牡丹离体再生或转基因抗性芽苗无法建成为自然植株，是目前业界公认的世界性难题。
嫁接，即接穗插入砧木，是一种传统而经典的植物繁殖方法。选择亲和力强的砧木和接穗是嫁接成功与否的关键。亲和力是指砧木和接穗经嫁接而能愈合的能力，一般情况下，亲缘关系越近，亲合力越强，嫁接的成活率也就越高。砧木和接穗的活力与健壮度、嫁接时机及嫁接技术等都是影响嫁接效率的重要因素。传统的嫁接法存在成本高、嫁接后成活率低、病虫害多等缺陷。
尽管现有技术中，牡丹嫁接技术已经被广泛应用，但是人们一般会采集带有多个芽的枝条作为接穗、与砧木进行嫁接，也即以自然生长枝条来与砧木进行嫁接。而嫁接技术是否可被应用于牡丹离体生根植株的培育生长并不清楚。因此，本领域还需要探索牡丹离体芽苗嫁接的可行性以及培养条件。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种芍药属木本植物离体对活体嫁接的方法。
在本发明的第一方面，提供一种牡丹离体对活体的微嫁接方法，所述的方法包括：
(1)以含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液浸泡牡丹种子，浸泡后的种子进行灭菌处理；
(2)将(1)的种子去除种壳，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的基本培养基中培养，之后转入基本培养基中，形成离体芽苗；
(3)将(2)的离体芽苗在含有萘乙酸和多效唑溶液中浸泡后，嫁接到砧木上，形成牡丹离体芽苗与砧木的微嫁接体；和
(4)种植(3)的微嫁接体，获得存活的植株。
在本发明的一个优选例中，步骤(2)中，将(1)的种子去除种壳，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的wpm基本培养基中培养，之后转入wpm基本培养基中，形成离体芽苗
在本发明的另一优选例中，步骤(3)中，所述的砧木如下获得：在3、4、5或10月将3-6年生的牡丹或芍药实生苗起苗，修剪掉主干，并在切口处灭菌处理，种植培养；较佳地，所述的牡丹是凤丹或紫斑牡丹；较佳地，所述的灭菌处理是以硫磺粉涂抹切口处。
在本发明的另一优选例中，步骤(3)中，离体芽苗嫁接到砧木上包括：将离体芽苗嫁接到牡丹或芍药实生苗的鳞芽切口上，在嫁接的缝隙处注入含有萘乙酸和多效唑的溶液以促进愈合。
在本发明的另一优选例中，步骤(1)中，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±30mg/l赤霉素(ga3)，1±0.3mg/l6苄基腺嘌呤，5±2mg/l硝酸钙。更佳地，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±20mg/l赤霉素，1±0.2mg/l6苄基腺嘌呤，5±1mg/l硝酸钙；更佳地，包括：100±10mg/l赤霉素，1±0.1mg/l6苄基腺嘌呤，5±0.5mg/l硝酸钙。
在本发明的另一优选例中，步骤(2)中，所述的添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的wpm基本培养基中，添加：5±2mg/l赤霉素，1±0.3mg/l6苄基腺嘌呤，1±0.3mg/l硝酸钙。更佳地，所述的添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的wpm基本培养基中，添加：5±1mg/l赤霉素，1±0.2mg/l6苄基腺嘌 呤，1±0.2mg/l硝酸钙；更佳地，添加：5±0.5mg/l赤霉素，1±0.1mg/l6苄基腺嘌呤，1±0.1mg/l硝酸钙。
在本发明的另一优选例中，步骤(2)中，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的wpm基本培养基中培养3-5周(较佳地3.5-4.5周，更佳地4周)；之后转入wpm基本培养基中培养10-14周(较佳地11-13周，更佳地12周)，形成离体芽苗；较佳地，在转入wpm基本培养基中培养后，每3-5周继代一次(较佳地每3.5-4.5周继代一次，更佳地每4周继代一次)。
在本发明的另一优选例中，所述的含有萘乙酸和多效唑溶液包括：0.05-1mg/l萘乙酸，0.005-0.1mg/l多效唑。更佳地，所述的含有萘乙酸和多效唑溶液包括：0.1-0.5mg/l萘乙酸，0.01-0.05mg/l多效唑。
在本发明的另一优选例中，步骤(1)中，所述的灭菌处理包括：以70％酒精和/或0.1％升汞浸泡，以无菌水或蒸馏水冲洗。
在在本发明的另一优选例中，步骤(1)中，浸泡时间为18-30小时，较佳地为20-28小时，如24小时。
本发明的另一优选例中，步骤(3)中，将离体芽苗切成薄片后在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡。
在本发明的另一优选例中，步骤(4)中，微嫁接体种植于播种基质中，该播种基质是泥炭、菜园土和珍珠岩为3∶6∶1的基质；较佳地，该播种基质在使用前经灭菌处理；较佳地，经121℃灭菌处理。
在本发明的另一优选例中，步骤(3)中，在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡的时间为10-30min；较佳地为15-25min；更佳地为20分钟。
在本发明的另一优选例中，步骤(3)中，嫁接后，离体芽苗与砧木之间用parafilm膜固定。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1a、苗龄为12周的离体芽苗。
图1b、切成薄片的离体接穗。
图1c、存活2周的离体对活体微嫁接。
图1d、存活4周的离体对活体微嫁接。
具体实施方式
为了克服牡丹离体生根植株移栽无法土壤建成的难题，尽快缓解牡丹优质育种材料的供需矛盾，大大缩短牡丹育种进程，本发明人致力于牡丹离体对活体的微嫁接研究，获得了离体诱导的牡丹芽苗嫁接到自然生长牡丹植株的多项技术参数，构建了牡丹离体对活体的微嫁接体系。
离体芽苗的制备
牡丹的离体芽苗的制备过程主要包括以下步骤：(1)以含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液浸泡牡丹种子，浸泡后的种子进行灭菌处理；和(2)将(1)的种子去除种壳，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的wpm基本培养基中培养，之后转入wpm基本培养基中，形成离体芽苗。
作为本发明的优选方式，步骤(1)中，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±30mg/l赤霉素(ga3)，1±0.3mg/l6苄基腺嘌呤，5±2mg/l硝酸钙。更优选地，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±20mg/l赤霉素，1±0.2mg/l6苄基腺嘌呤，5±1mg/l硝酸钙；更佳地，包括：100±10mg/l赤霉素，1±0.1mg/l6苄基腺嘌呤，5±0.5mg/l硝酸钙。本发明人在实践中发现，对于牡丹的种子进行该浸泡处理有利于后续的种子萌发和芽苗生长。
作为本发明的优选方式，步骤(2)中，所述的添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的wpm基本培养基中，添加：5±2mg/l赤霉素，1±0.3mg/l6苄基腺嘌呤+1±0.3mg/l硝酸钙。更优选地，所述的添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的wpm基本培养基中，添加：5±1mg/l赤霉素，1±0.2mg/l6苄基腺嘌呤+1±0.2mg/l硝酸钙；更佳地，添加：5±0.5mg/l赤霉素，1±0.1mg/l6苄基腺嘌呤+1±0.1mg/l硝酸钙。
作为本发明的优选方式，步骤(2)中，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸 钙的wpm基本培养基中培养3-5周，较佳地3.5-4.5周，更佳地4周；之后转入wpm基本培养基中培养10-14周，较佳地11-13周，更佳地12周，形成离体芽苗。
作为本发明的优选方式，步骤(2)中，在转入wpm基本培养基中培养后，每3-5周继代一次；较佳地每3.5-4.5周继代一次；更佳地每4周继代一次。更换新鲜的培养基有利于提供芽苗更充分的营养。
作为本发明的优选方式，步骤(1)中，所述的灭菌处理包括：以70％酒精和/或0.1％升汞浸泡，以无菌水或蒸馏水冲洗。作为本发明的优选方式，浸泡时间为18-30小时，较佳地为20-28小时，如24小时。应理解，只要能够杀灭微生物以及不伤害到植物生长，其它灭菌方式也是可以的。
砧木的准备
砧木(rootstock)是嫁接繁殖时承受接穗的植株。砧木是果树嫁接苗的基础，起固着、支撑接穗并与接穗愈合后形成植株生长、结果。
作为本发明的优选方式，所述的砧木如下获得：在3、4、5或10月将3-6年生的牡丹或芍药实生苗起苗，修剪掉主干，并在切口处灭菌处理，种植培养；较佳地，所述的牡丹是凤丹或紫斑牡丹。
所述的灭菌处理是以硫磺粉涂抹切口处。应理解，只要能够杀灭微生物以及不伤害到植物生长，其它灭菌方式也是可以的。
微嫁接
在制备好牡丹的离体芽苗和砧木后，可以实施将两者的嫁接。
将牡丹的离体芽苗在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡，之后嫁接到砧木上，形成牡丹离体芽苗与砧木的微嫁接体。
作为本发明的优选方式，用于浸泡离体芽苗的含有萘乙酸和多效唑的溶液包括：0.05-1mg/l萘乙酸，0.005-0.1mg/l多效唑。更优选地，在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡的时间为10-30min；较佳地为15-25min；更佳地为20分钟。本发明人在实践中发现，这一浸泡的步骤促发愈伤组织、促进木质化，有利于促进离体芽苗在嫁接时的存活，以及有利于其在嫁接后的生长发育。
作为本发明的优选方式，所述的含有萘乙酸和多效唑的溶液包括：0.1-0.5mg/l萘乙酸，0.01-0.05mg/l多效唑。
作为本发明的优选方式，将离体芽苗切成薄片后在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡，促发愈伤组织、促进木质化，利于微嫁接。将离体芽苗切成薄片有利于接穗对促愈剂的吸收，便于嫁接机械操作。
作为本发明的优选方式，离体芽苗嫁接到砧木上包括：将离体芽苗嫁接到牡丹或芍药实生苗的鳞芽切口上，在嫁接的缝隙处注入含有萘乙酸和多效唑的溶液以促进愈合。
作为本发明的优选方式，嫁接后，离体芽苗与砧木之间用parafilm膜固定，从而为离体芽苗与砧木的有效接合以及稳定生长提供支撑，获得状态良好的微嫁接体。
微嫁接体的培养
在获得了所述微嫁接体后，种植该微嫁接体，获得存活的植株。
所述的微嫁接体种植于播种基质中，该播种基质是泥炭、菜园土和珍珠岩为3∶6∶1的基质。应理解，根据种植时间、气候等因素的不同，播种基质的成分可以有所不同。并且，在上述比例的基础上，可以进行适当的调整，这是本领域技术人员易于做到的。
作为本发明的优选方式，该播种基质在使用前经灭菌处理；较佳地，经121℃灭菌处理。应理解，只要能够杀灭播种基质中的微生物，其它灭菌方式也是可以的。
本发明提供的牡丹离体对活体嫁接技术，与现有技术中一般的嫁接技术相比的本质差别在于接穗的不同，前者为离体再生的芽苗，后者为自然生长枝条，前者的技术难度大。本发明的方法克服了芍药属木本植物牡丹离体生根植株移栽无法土壤建成的难题，可缓解现有技术中牡丹优质育种材料的供需矛盾，大大缩短了牡丹育种的进程。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料准备
1、种胚材料
凤丹牡丹的种子，每年8月下旬采集种子，采后去荚、阴凉处风干，塑料袋分装，4℃或-20℃冰箱保存备用。
2、母液制备
100mg/l和5mg/l的赤霉素(ga3)溶液，用分析纯酒精助溶。
1mg/l6苄基腺嘌呤(6-ba)和1mg/l萘乙酸(naa)，分别用1mol/lhcl助溶，4℃冰箱保存。
5mg/lca(no3)2，直接溶于水，常温保存。
3、培养基及消毒液(剂)
(1)wpm基本培养基
可在该培养基中按需添加植物激素等，121℃灭菌20min，用于培养离体芽苗。
(2)离体培养材料消毒液
70％酒精，0.1％升汞(hgcl2)，用于起始外植体消毒。
(3)活体材料消毒剂
硫磺粉，用于活体材料切口消毒。
实施例1、牡丹的离体芽苗及活体材料(砧木)的制备
1、离体芽苗(接穗)的培养
(1)选取饱满的凤丹的种子，用100mg/l赤霉素(ga3)+1mg/l6-ba+5 mg/lca(no3)2混合液浸泡24h；
(2)在超净工作台上，70％酒精浸泡60s，0.1％升汞(hgcl2)浸泡10min，无菌水或蒸馏水冲洗3次，滤纸吸干；
(3)剥除牡丹种壳，将种胚接种在添加5mg/lga3+1mg/l6-ba+1mg/lca(no3)2的wpm基本培养基中培养4周；再转入wpm基本培养基中培养，每4周继代一次。12周后，作为接穗的离体芽苗(图1a)形成，以备用。
2、活体材料(砧木)的制备
每年3、4、5、10月将3-6年生凤丹、紫斑牡丹或芍药实生苗起苗(从土壤中挖出来)，修剪掉主干，并在切口处涂抹硫磺粉，再种植于容器中，常规化栽培管理。播种基质：泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质，使用前121℃灭菌60min，用于栽植各种微嫁接植株。
实施例2、微嫁接植株的制备和培养1
1、形成牡丹离体芽苗对活体砧木的微嫁接体
将wpm培养基中培养12周的离体芽苗(接穗)切成薄片(图1b)(茎部切薄)，浸泡在0.3mg/l萘乙酸(naa)+0.03mg/l多效唑(met：multi-effecttriazole)的促愈剂中浸泡20min后，嫁接到3年生凤丹实生苗的鳞芽切口上，再用注射器在砧木与接穗的缝隙处注入上述促愈剂。非砧木切口用硫磺粉消毒处理。接穗和砧木之间用parafilm膜固定，形成牡丹离体芽苗对活体砧木的微嫁接体(图1c)。
2、微嫁接植株的培养
(1)将微嫁接体种植于播种基质中，在黑暗、22-30℃、相对湿度为80-90％的条件下培养2周。
(2)将微嫁接体种植于播种基质中，在光照、22-30℃、相对湿度为60-80％的条件下培养2周，形成具有自主生活能力的微嫁接体(图1d)。
播种基质：泥炭、菜园土和珍珠岩(3∶6∶1)的基质，使用前121℃灭菌60min，用于栽植各种微嫁接植株。
实施例3、微嫁接植株的制备和培养2
1、形成牡丹离体芽苗对活体砧木的微嫁接体
将wpm培养基中培养12周的离体芽苗(接穗)切成薄片，浸泡在含有0.1mg/lnaa+0.01mg/l多效唑(met：multi-effecttriazole)的促愈剂中浸泡30min后，嫁接到4年生紫斑牡丹实生苗的鳞芽切口上，再用注射器在砧木与接穗的缝隙处注入上述促愈剂。非砧木切口用硫磺粉消毒处理。接穗和砧木之间用parafilm膜固定，形成牡丹离体芽苗对活体砧木的微嫁接体。
2、微嫁接植株的培养
(1)将微嫁接体种植于步骤5的基质中，在黑暗、22-30℃、相对湿度为80-90％的条件下培养2周。
(2)将微嫁接体种植于步骤5的基质中，在光照、22-30℃、相对湿度为60-80％的条件下培养2周，形成具有自主生活能力的微嫁接体。
实施例4、微嫁接植株的制备和培养3
1、形成牡丹离体芽苗对活体砧木的微嫁接体
将wpm培养基中培养12周的离体芽苗(接穗)切成薄片，浸泡在0.5mg/lnaa+0.05mg/l多效唑(met：multi-effecttriazole)的促愈剂中浸泡10min后，嫁接到5年生芍药实生苗的鳞芽切口上，再用注射器在砧木与接穗的缝隙处注入上述促愈剂。非砧木切口用硫磺粉消毒处理。接穗和砧木之间用parafilm膜固定，形成牡丹离体芽苗对活体砧木的微嫁接体。
2、微嫁接植株的培养
(1)将微嫁接体种植于步骤5的基质中，在黑暗、22-30℃、相对湿度为80-90％的条件下培养2周。
(2)将微嫁接体种植于步骤5的基质中，在光照、22-30℃、相对湿度为60-80％的条件下培养2周，形成具有自主生活能力的微嫁接体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。