本技术涉及一种抗刺激隐核虫珍珠龙胆石斑鱼苗种的生产方法，属于抗病性鱼苗生产领域，具体为抗刺激隐核虫鱼苗生产领域。
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：珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus×Epinepheluslanceolatus)，为鮨科、石斑鱼属的雌性褐点石斑鱼和雄性鞍带石斑鱼杂交培育的新型石斑鱼，其兼具父本和母本的优势，生长速度快、抗逆性强，且肉质鲜美，成为中国海水养殖鱼类的新宠，在广东和海南等地都有大面积养殖。刺激隐核虫病俗称海水鱼白点病，是由一种海水鱼类专性寄生纤毛虫----刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)引起的致死性寄生虫病(ColorniandBurgess，1997)。近年来，刺激隐核虫病已经成为我国危害最严重的寄生虫病之一，给海水渔业造成了巨大的危害(Luoetal.，2008)，被列为国家《一、二、三类动物疫病病种名录》中唯一的水生动物二类疫病(农业部，2008)。刺激隐核虫的宿主范围很广泛，除软骨鱼类对刺激隐核虫有较强抵抗力外，海水硬骨鱼类普遍能被刺激隐核虫感染，其中珍珠龙胆石斑鱼也是刺激隐核虫感染的对象之一。由于刺激隐核虫生活史的复杂性，使得该病的防控非常困难。目前生产上主要采用药物防治如福尔马林、硫酸铜、吖啶黄、孔雀绿、亚甲基兰、喹林派、甲硝哒唑、高锰酸钾、氯化钠、磺胺噻唑、呋喃唑酮和青霉素等(ColorniandBurgess，1997；蔡泽平等，2001；Noritakaetal.，2001；Noritakaetal.，2003；黄玮等，2004)，然而这些方法由于存诸多缺陷，如效果不稳定、破坏养殖环境、危害食品安全、实施不便等，很难达到理想的效果。Colorni(1987)提议用不同的物理方法防治刺激隐核虫病，其中一种方法是将鱼在2个水族箱中进行轮换饲养，空置的水族箱进行干燥和清洁处理。这种方法很有效，但是他没有给出具体的操作方法，特别是没有给出不同温度下轮换的频率和总共需要的时间这两个关键数据。张团委(2012)测定了卵形鲳鲹和斜带石斑鱼在不同温度下感染刺激隐核虫的轮换频率和轮换周期，但是没有测定这种方法是否会诱发海水鱼产生获得性免疫保护。目前研究证实，海水鱼类对刺激隐核虫感染会产生获得性免疫保护，疫苗接种可能成为防治刺激隐核虫病的有效方法(Yoshinagaetal，1997；Yambotetal，2006；Luoetal，2007；HatanakaandHirazawa，2008)。近年来研究者开展了一些刺激隐核虫免疫防治的基础研究和应用研究，发现用刺激隐核虫幼虫经体表感染海水鱼如斜带石斑鱼、卵形鲳鲹等，可以达到80％以上的免疫保护率(Luoetal，2007；但学明等，2008；Yoshinagaetal，1997)，但是这些实验的有效免疫保护期最长只能达到3个月，且没有详细研究不同温度对海水鱼获得性免疫保护力的影响。在实际生产过程中，迫切需要一种有效免疫保护期较长的珍珠龙胆石斑鱼苗种，为满足此需要，申请人经多次试验和尝试，摸索出了一种有效免疫保护期较长的、抗刺激隐核虫珍珠龙胆石斑鱼苗种的生产方法。技术实现要素：本发明旨在克服抗刺激隐核虫的珍珠龙胆石斑鱼苗种免疫保护期过短、不适应工业化养殖生产等缺点，提供了一种实用性较强的抗刺激隐核虫珍珠龙胆石斑鱼苗种的生产方法。本发明将采用独特的变温感染和轮换养殖方法，培育出抗刺激隐核虫感染的珍珠龙胆石斑鱼苗种，这种珍珠龙胆石斑鱼苗对刺激隐核虫的免疫保护力要达到8个月以上，免疫后第8个月还具有58％的相对保护率，第9个月仍有32％的相对保护率。本发明的独特之处在于，首次采用变温感染和变温养殖的方式来生产抗病性的石斑鱼苗种，感染时的水温与感染后10天内的养殖水温保持一定温差，从而增强刺激隐核虫活幼虫的免疫效果，进而与轮换养殖结合，获得了有效免疫保护期较长的抗刺激隐核虫珍珠龙胆石斑鱼苗种。本发明的优势在于，解决了一直困扰养殖户的海水鱼类苗种免疫保护期短的技术问题，采用独创性的感染养殖方式，生产出了有效免疫保护期长达8个月的抗刺激隐核虫珍珠龙胆石斑鱼苗种，适用于养殖厂及养殖户的珍珠龙胆石斑鱼健康养殖，可减免海水白点病所带来的巨大损失，大大提高渔民的养殖效益。本发明是通过以下技术方案实现的：1.刺激隐核虫活幼虫的收集和浓度计算利用专门的刺激隐核虫传代系统对刺激隐核虫进行传代和收集，其传代宿主为卵形鲳鲹，采集发育良好的刺激隐核虫包囊，置于消过毒的干净烧杯中孵化，孵化用水为高压灭菌的、加入适量青霉素和链霉素的自然海水；收集孵出2小时内的刺激隐核虫幼虫液，充分混匀后取50μL虫液，加10μL甲醛将幼虫杀死，在显微镜下计数，记算出幼虫液的活虫浓度。2.珍珠龙胆石斑鱼苗种驯养、感染购置13g左右的珍珠龙胆石斑鱼苗种，感染前2周对鱼苗进行试养驯化，直至其进食、活动正常，在整个养殖过程中，饲养用水用600目的滤网过滤，其盐度在30‰左右，pH为8左右，溶氧量在5.6mg/L以上；将珍珠龙胆石斑鱼苗种分为对照组和实验组(第1-9组)共十个小组，实验组每组鱼苗用孵出2小时内的刺激隐核虫幼虫感染，感染时水温第1-3组为24℃、第4-6组为27℃、第7-9组为30℃，感染用水量为1L海水/尾鱼，感染剂量为8000个幼虫/尾鱼；感染6小时后分别把鱼苗放入不同的轮养池中，其中第1、4、7组水温控制在24℃，第2、5、8组水温控制在27℃，第3、6、9组水温控制在30℃；对照组不进行刺激隐核虫感染，养殖水温为27℃。轮养池长40米，宽1.5米，高1米，池中间用密封隔板将养殖池一分为二，保证两侧水不互通，感染后的鱼苗全部放置在池的一侧，加入终浓度为2ppm的聚维酮碘溶液(有效碘含量为10％)预防继发感染。具体分组情况见下表：组号感染水温(℃)养殖水温(℃)对照组未感染2712424224272-->324304272452727627307302483027930303、感染后珍珠龙胆石斑鱼苗种的轮换养殖为了保证珍珠龙胆石斑鱼苗种不被脱落的刺激隐核虫包囊孵出的幼虫再次感染，每2天要将苗种置换到干净的池中养殖，对照组鱼种按同样方法换池。具体方法为：将轮养池中间的密封隔板拔出，采用诱食和驱赶方法将全部鱼苗集中到池的另一侧，插上密封隔板，加入终浓度为2ppm的聚维酮碘溶液(有效碘含量为10％)预防继发感染。排净原来养鱼一侧的海水，加入30cm深的淡水，浸泡8小时，即可杀灭所有粘附于池底的刺激隐核虫包囊，刷洗后排净淡水，加注干净海水待下一次使用。按上述方法轮换养殖5次，鱼体上的刺激隐核虫全部脱落，整个轮换养殖过程均保持以上的控温方式。此后将免疫过的鱼苗全部放入干净的养殖池中养殖，不必控温，保持自然水温。4、致死剂量的测定和有效免疫保护期的测定珍珠龙胆石斑鱼致死剂量的测定在攻毒前两周进行。从空白对照组随机取50尾鱼，分为10组，每组5尾，在塑料桶内分开喂养。在幼虫脱包高峰期，收集和计数2小时内脱包的活跃幼虫，分别用设定好的剂量梯度感染10组鱼，感染用水量为1L海水/尾鱼。统计一周内各组鱼的死亡数，能使5尾珍珠龙胆石斑鱼全部死亡的最低感染剂量就是该鱼的刺激隐核虫致死剂量。攻毒：每30天从对照组和每组免疫过的鱼苗中各取50尾鱼，用致死剂量的刺激隐核虫幼虫攻毒。攻毒时空白对照组和实验组混养在一起，海水用量仍为每尾鱼1L，同时用致死剂量的幼虫进行感染攻毒，统计各个实验组7天内实验鱼的死亡情况，计算免疫9个月内的相对保护率，刺激隐核虫攻毒后实验鱼的相对保护率(RPS)，RPS＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％。结果发现：与没有免疫过的对照组相比，免疫过的珍珠龙胆石斑鱼苗种死亡率有显著降低，其中第8组(30℃感染，27℃养殖)有效免疫保护期最长，免疫后第8个月还具有58％的相对保护率，第9个月仍有32％的相对保护率。因此，30℃感染，27℃养殖的方法能让珍珠龙胆石斑鱼获得最长的有效免疫保护期，可以采取该方法来生产抗刺激隐核虫的珍珠龙胆石斑鱼苗种。本发明的优点和效果：1、感染和轮换养殖操作简单易行，且不损伤鱼体，感染时无需捞取鱼苗，轮换养殖时也只需要将池中间的密封隔板拔出，采用诱食和驱赶方法就可把全部鱼苗集中到池的另一侧，此方法对鱼体无任何损伤，且简单易行。2.采用独特的变温感染和轮换养殖方法能让珍珠龙胆石斑鱼获得最长的有效免疫保护期，采用30℃感染，27℃养殖的方法能让珍珠龙胆石斑鱼在免疫后第8个月还具有58％的相对保护率，第9个月仍有32％的相对保护率。此方法产生的有效免疫保护期比以前任何报道的方法都要长。具体实施方式1.刺激隐核虫活幼虫的收集和浓度计算利用专门的刺激隐核虫传代系统对刺激隐核虫进行传代和收集，其传代宿主为卵形鲳鲹，采集发育良好的刺激隐核虫包囊，置于消过毒的干净烧杯中孵化，孵化用水为高压灭菌的、加入适量青霉素和链霉素的自然海水；收集孵出2小时内的刺激隐核虫幼虫液，充分混匀后取50μL虫液，加10μL甲醛将幼虫杀死，在显微镜下计数，记算出幼虫液的活虫浓度。2.珍珠龙胆石斑鱼苗种驯养、感染购置13g左右的珍珠龙胆石斑鱼苗种，感染前2周对鱼苗进行试养驯化，直至其进食、活动正常，在整个养殖过程中，饲养用水用600目的滤网过滤，其盐度在30‰左右，pH为8左右，溶氧量在5.6mg/L以上；将珍珠龙胆石斑鱼苗种分为对照组和实验组(第1-9组)共十个小组，实验组每组鱼苗用孵出2小时内的刺激隐核虫幼虫感染，感染时水温第1-3组为24℃、第4-6组为27℃、第7-9组为30℃，感染用水量为1L海水/尾鱼，感染剂量为8000幼虫/尾鱼；感染6小时后分别把鱼苗放入不同的轮养池中，其中第1、4、7组水温控制在24℃，第2、5、8组水温控制在27℃，第3、6、9组水温控制在30℃；对照组不进行刺激隐核虫感染，养殖水温为27℃。轮养池长40米，宽1.5米，高1米，池中间用密封隔板将养殖池一分为二，保证两侧水不互通，感染后的鱼苗全部放置在池的一侧，加入终浓度为2ppm的聚维酮碘溶液(有效碘含量为10％)预防继发感染。具体分组情况见下表：组号感染水温(℃)养殖水温(℃)对照组未感染271242422427324304272452727627307302483027930303、感染后珍珠龙胆石斑鱼苗种的轮换养殖为了保证珍珠龙胆石斑鱼苗种不被脱落的刺激隐核虫包囊孵出的幼虫再次感染，每2天要将苗种置换到干净的池中养殖，对照组鱼种按同样方法换池。具体方法为：将轮养池中间的密封隔板拔出，采用诱食和驱赶方法将全部鱼苗集中到池的另一侧，插上密封隔板，加入终浓度为2ppm的聚维酮碘溶液(有效碘含量为10％)预防继发感染。排净原来养鱼一侧的海水，加入30cm深的淡水，浸泡8小时，即可杀灭所有粘附于池底的刺激隐核虫包囊，刷洗后排净淡水，加注干净海水待下一次使用。按上述方法轮换养殖5次，鱼体上的刺激隐核虫全部脱落，整个轮换养殖过程均保持以上的控温方式。此后将免疫过的鱼苗全部放入干净的养殖池中养殖，不必控温，保持自然水温。4、致死剂量的测定和有效免疫保护期的测定珍珠龙胆石斑鱼致死剂量的测定在攻毒前两周进行。从空白对照组随机取50尾鱼，分为10组，每组5尾，在塑料桶内分开喂养。在幼虫脱包高峰期，收集和计数2小时内脱包的活跃幼虫，分别用设定好的剂量梯度感染10组鱼，感染用水量为1L海水/尾鱼。统计一周内各组鱼的死亡数，能使5尾珍珠龙胆石斑鱼全部死亡的最低感染剂量就是该鱼的刺激隐核虫致死剂量。攻毒：每30天从对照组和每组免疫过的鱼苗中各取50尾鱼，用致死剂量的刺激隐核虫幼虫攻毒。攻毒时空白对照组和实验组混养在一起，海水用量仍为每尾鱼1L，同时用致死剂量的幼虫进行感染攻毒，统计各个实验组7天内实验鱼的死亡情况，计算免疫9个月内的相对保护率，刺激隐核虫攻毒后实验鱼的相对保护率(RPS)，RPS＝(对照组死亡率-免疫组死亡率)/对照组死亡率×100％。结果发现：与没有免疫过的对照组相比，免疫过的珍珠龙胆石斑鱼苗种死亡率有显著降低，其中第8组(30℃感染，27℃养殖)有效免疫保护期最长，免疫后第8个月还具有58％的相对保护率，第9个月仍有32％的相对保护率。因此，30℃感染，27℃养殖的方法能让珍珠龙胆石斑鱼获得最长的有效免疫保护期，可以采取该方法来生产抗刺激隐核虫的珍珠龙胆石斑鱼苗种。当前第1页1 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