本发明涉及河蚌的多倍体繁育方法，具体涉及河蚌的三倍体纯系高效育成方法。
背景技术：
河蚌，又名河歪、河蛤蜊、鸟贝、西施舌等，属于软体动物门瓣鳃纲蚌科，是一种以滤食藻类为生的贝壳类水生动物。常见的有角背无齿蚌、褶纹冠蚌、三角帆蚌、丽蚌等数十种，我国大部分地区的河湖水泊中有出产。河蚌肉质特别脆嫩可口，是筵席之佳肴，更是人工育珠的好材料。河蚌的繁殖，雌蚌成熟的卵经生殖孔排至身体外套腔中；雄蚌成熟的精子由输精管经生殖孔排至鳃上腔，再经出水管排到体外水体中。精子随水进入雌蚌外套腔中与待孕的卵结合，完成受精，受精卵就在母蚌的左右两侧外鳃瓣上进行胚胎发育，以下称为“怀卵”母蚌。三倍体河蚌的不育特征，使其在生长速度、抗逆性、抗病性以及肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，到目前为止，还未见用此中方法生产三倍体河蚌的方法，更未见用全雄四倍体与二倍体母本回交的先例。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定、种群纯度高达100%的河蚌三倍体纯系高效育成方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
河蚌三倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到河蚌人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为10～20g/500g喂养料，待用；
（2）投喂：在母蚌产卵前5～10天，按常规饲料投喂方法对母蚌进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蚌投喂5～10g，下午6：00每100g母蚌投喂8～10g；至其卵发育成熟，然后，取公蚌在吊养在一起，使其自然产卵受精，得受精“怀卵”母蚌；
（3）热休克处理：观察“怀卵”母蚌受精卵的发育情况，在受精卵第一次卵裂前2～3min，把上述“怀卵”母蚌放入溶氧达5～8mg/l（通过人工充氧）、温度为39～42℃恒温水中，热休克3～5min，待用；
（4）雌激素抑制剂溶液配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为120～240mg/l，睾酮的浓度为10～50mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的“怀卵”母蚌，放入用步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温泡浴90～150S，“怀卵”母蚌与溶液重量比为1：2，通过充氧，使溶液中的氧气含量达5～10mg/l；
（6）取步骤（5）处理后的“怀卵”母蚌，放入育苗池中进行常规培育；直至产出钩介幼虫，寄生到鱼体，再脱落，形成仔蚌，从而获得河蚌的雄性四倍体纯系；
（7）三倍体河蚌的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
本发明的优点：1、本发明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA复制和促雄性的双重作用的同时，推延了受精卵第一次卵裂的时间（3-5min）和提高了同步程度（高达99%），为操作下一步提供时间保障和奠定染色体加倍的基础；2、采用热休克短时间处理受精卵，有效降低对长时间热休克对受精卵的破坏作用，提高受精卵的成活率；3、雌激素抑制剂溶液浸泡，再一次强化与保证雄性转化率；4、用纯系的雄性四倍体与原有的雌性二倍体回交，有效保证了三倍体的纯度。因而通过此方法，可获得100%的河蚌三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要是对自然水产品种种质和生态环境无污染。
具体实施方式
现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
实施例一
河蚌三倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到河蚌人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为10g/500g饲料，待用；
（2）投喂：在母蚌产卵前5天，按常规饲料投喂方法对母蚌进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蚌投喂10g，下午6：00每100g母蚌投喂10g；至其卵发育成熟，然后，取公蚌在吊养在一起，使其自然产卵受精，得受精“怀卵”母蚌；
（3）热休克处理：观察“怀卵”母蚌受精卵的发育情况，在受精卵第一次卵裂前3min，把步骤（2）中的“怀卵”母蚌放入溶氧达8mg/l（通过人工充氧）、温度为42℃恒温水中，热休克3min，待用；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为200mg/l，睾酮的浓度为40mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的“怀卵”母蚌，放入用步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温泡浴120S，“怀卵”母蚌与溶液比为1：2，通过充氧，使溶液中的氧气含量达10mg/l；
（6）取步骤（5）处理后的“怀卵”母蚌，放入育苗池中进行常规培育，直至产出钩介幼虫，寄生到鱼体，再脱落，形成仔蚌，从而获得河蚌的雄性四倍体纯系；
（7）三倍体河蚌的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
实施例二
河蚌三倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到河蚌人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为20g/500g饲料，待用；
（2）投喂：在母蚌产卵前10天，按常规饲料投喂方法对母蚌进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蚌投喂5g，下午6：00每100g母蚌投喂8g；至其卵发育成熟，然后，取公蚌在吊养在一起，使其自然产卵受精，得受精“怀卵”母蚌；
（3）热休克处理：观察“怀卵”母蚌受精卵的发育情况，在受精卵第一次卵裂前2min，把步骤（2）中的“怀卵”母蚌放入溶氧达5mg/l（通过人工充氧）、温度为39℃恒温水中，热休克3min，待用；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为240mg/l，睾酮的浓度为50mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的“怀卵”母蚌，放入用步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温泡浴90S，“怀卵”母蚌与溶液比为1：2，通过充氧，使溶液中的氧气含量达10mg/l；
（6）取步骤（5）处理后的“怀卵”母蚌，放入育苗池中进行常规培育，直至产出钩介幼虫，寄生到鱼体，再脱落，形成仔蚌，从而获得河蚌的雄性四倍体纯系；
（7）三倍体河蚌的获得：取步骤（6）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式及结果统计。
附：河蚌三倍体育成结果统计
注：上述结果是在母本产卵前10天投喂他莫昔芬，受精卵第一次卵裂前2min、溶氧达5mg/l、热休克3min，雌激素抑制剂浸泡90s所取得的结果。