本发明涉及乌龟的繁育方法，具体涉及一种乌龟三倍体纯系高效育成的方法。
背景技术：
乌龟隶属爬行纲、龟鳖目、龟科，是现存古老的爬行动物，常见的为二倍体，身上长有非常坚固的甲壳，雌龟生长速度为一领龄龟体重在15克左右，二龄龟50克，三龄龟100克，四龄龟200克，无龄龟250克，雄龟生长慢，性成熟最大个体一般为250克以下。因三倍体的不育特征，使乌龟在生长速度、抗病性、肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，要获得三倍体不育乌龟，最快捷有效的方式是通过四倍体乌龟与二倍体乌龟倍间杂交获得，那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体乌龟体系。但在乌龟的遗传育种中，目前为止还未见乌龟三倍体高效育成的报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定、种群纯度高达100%的乌龟三倍体纯系高效育成的方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
乌龟三倍体纯系高效育成的方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌龟常规饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为10～16g/500g喂养料，待用；
（2）投喂：在母龟产蛋前5～10天，按常规饲料投喂方法对母本进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g乌龟投喂20～30g，下午6：00每100g乌龟投喂10～15g，直至产蛋；
（3）冷休克处理：在一次卵裂时，采用冷休克的方法，把步骤（2）中的受精蛋放入温度为-1～1℃的冷箱中，持续时间为3～5min；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为180～250mg/l，睾酮的浓度为100～150mg/l；
（5）用步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液，放入喷雾器中，对步骤（3）处理后的受精蛋进行均匀喷雾，用量每100只受精蛋为10～20ml，保持孵化器的温度29～33℃、湿度50～90%，进行孵化；从而获得乌龟雄性四倍体纯系。
（6）取步骤（5）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
本发明的优点：1、本发明中对母本进行添加他莫昔芬饲料投喂，起到抑制DNA分裂和促雄性的双重作用的同时，将受精蛋第一次卵裂的时间推迟了3～5min，并提高所有受精蛋第一次卵裂的同步程度（可达99%），为操作下一步提供时间保障和奠定染色体加倍基础；2、在受精卵第一次卵裂采用冷休克处理，进一步阻止其染色体分裂，加强了四倍体的形成机率；3、雌激素抑制剂溶液喷洒，再一次强化与保证其雄性的转化率；4、用纯系的雄性四倍体与原有的雌性二倍体回交，有效保证了三倍体的纯度。因而通过此方法，可获得100%的三倍体纯系，提高了三倍体的育成率与出苗率，减少了育种与选种的麻烦，更主要是对自然水产品种种质和生态环境无污染。
具体实施方式
现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
实施例一
乌龟三倍体纯系高效育成的方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌龟常规饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为16g/500g喂养料，待用；
（2）投喂：在母龟产蛋前5天，按常规饲料投喂方法对母本进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g乌龟投喂30g喂养料，下午6：00每100g乌龟投喂15g喂养料；
（3）冷休克处理：在一次卵裂时，采用冷休克的方法，把步骤（2）中的受精蛋放入温度为0℃的冷箱中，持续时间为5min；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为180mg/l，睾酮的浓度为100mg/l；
（5）用步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液，放入喷雾器中，对步骤（3）中的受精蛋进行均匀喷雾，用量每100只受精蛋为15ml，保持孵化器的温度29℃、湿度80%，进行孵化；从而获得乌龟雄性四倍体纯系。
（6）取步骤（5）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
实施例二
乌龟三倍体纯系高效育成的方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到乌龟常规饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为16g/500g饲料，待用；
（2）投喂：在母龟产蛋前10天，按常规饲料投喂方法对母本进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g乌龟投喂25g，下午6：00每100g乌龟投喂15g；
（3）冷休克处理：在一次卵裂时，采用冷休克的方法，把步骤（2）中的受精蛋放入温度为-1℃的冷箱中，持续时间为3min；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为230mg/l，睾酮的浓度为140mg/l；
（5）用步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液，放入喷雾器中，对步骤（3）中的受精蛋进行均匀喷雾，用量每100只受精蛋为20ml，保持孵化器的温度33℃、湿度70%，进行孵化；从而获得乌龟雄性四倍体纯系。
（6）取步骤（5）的雄性四倍体作为父本，取普通二倍体作为母本，采用回交的方式，获得100%三倍体。
上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式及结果统计。
附：乌龟三倍体育成结果统计
注：上述结果是母龟产蛋前10天投喂他莫昔芬喂养料，冷休克3min所取得的结果。