降低二氯喹啉酸致畸影响的烟草安全种植方法与流程

本发明涉及烟草种植技术领域，更具体地，涉及一种降低二氯喹啉酸致畸影响的烟草安全种植方法。

背景技术：

化学农药在农作物病虫害防治，保障农业丰收发挥了巨大作用，在农业现代化进程中仍将继续发挥重要作用。但是，在我们使用农药的过程中，如不能科学合理的使用，如超量施用、不对症施用、乱混乱用，不仅达不到防治病虫草害的目的，反而对保护对象造成伤害，如出现药害，农作物不能正常生长发育，严重的枯萎死亡。

广东曾有烟叶产区因水稻田施用二氯喹啉酸防治杂草后，第二年种植烟草则出现生长畸形，烟叶质量明显下降，造成了较大的经济损失，严重影响烟农种烟的积极性，阻碍了烟区的稳定和发展。针对该问题，广东省烟草公司联合相关科研院所开展了研究攻关，查明致畸原因是因土壤残留二氯喹啉酸等除草剂致烟草畸形生长。据初步估算，施用农药的利用率一般为10％，约90％残留在环境中，残留环境中的农药经不同循环途径，最终大多数残留归于土壤中。这些残留土壤的农药经生物的、物理的和化学的因素得于降解。其中以微生物的降解作用最为重要，其降解速度还与农药的种类、土壤水分含量和pH值有密切的关系。二氯喹啉酸残留对后茬作物的药害程度，同样与其在土壤中的降解速率有关。

在烟草种植过程中，通常需要喷施杀菌剂防治白粉病、赤星病等病害，但目前并无烟田杀菌处理与二氯喹啉酸的降解速度之间影响关系的相关研究。因此进一步提供一种适应地域全面的降低二氯喹啉酸致畸影响的烟草安全种植方法对我国烟草种植具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是针对不同土壤条件下降低二氯喹啉酸致畸影响种植技术不足，提供一种降低二氯喹啉酸致畸影响的烟草安全种植方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种降低二氯喹啉酸致畸影响的烟草安全种植方法，是将施用过二氯喹啉酸的土壤不采用杀菌处理种植烟苗，或施用二氯喹啉酸48.6～66.7天后再对种植烟苗的土壤进行杀菌处理。

优选地，所述施用二氯喹啉酸48.6～66.7天后，经检测每千克土壤中的二氯喹啉酸残留浓度不大于0.02mg/kg时再进行烟苗种植。

优选地，所述烟苗安全种植的间隔天数为246.00天以上。

优选地，所述烟苗安全种植的间隔期范围为246.00～385.28天。

本发明具有以下有益效果：

本发明综合研究了杀菌处理和二氯喹啉酸的施用之间的平衡关系，总结得到不同土壤处理条件下的二氯喹啉酸残留降解规律，并总结出可安全种植烟苗的土壤条件、适合于安全种植烟苗的每千克土壤中的二氯喹啉酸最大残留浓度以及安全种植烟苗的间隔时间，从而为合理使用二氯喹啉酸，避免对后茬敏感作物造成残留药害和确定种植时间提供科学依据。

附图说明

图1二氯喹啉酸标准曲线图。

图2二氯喹啉酸标准溶液(5μg/ml)色谱图。

图3二氯喹啉酸在南雄土壤中的消解曲线图。

图4二氯喹啉酸在铁卢湖土壤中的消解曲线图。

图5二氯喹啉酸在辽宁阜新土壤中的消解曲线图。

图6二氯喹啉酸在云南楚雄土壤中的消解曲线图。

图7二氯喹啉酸在云南玉溪土壤中的消解曲线图。

图8二氯喹啉酸在云南红河土壤中的消解曲线图。

图9二氯喹啉酸在财塘段土壤中的消解曲线图。

图10二氯喹啉酸在云南易门土壤中的消解曲线图。

图11二氯喹啉酸在梅州夫子段土壤中的消解曲线图。

图12二氯喹啉酸在梅州夫子段云南大理土壤中的消解曲线图。

图13二氯喹啉酸在湖北恩施土壤中的消解曲线图。

图14二氯喹啉酸在河南平顶山土壤中的消解曲线图。

图15二氯喹啉酸在贵州黔西南州中的消解曲线图。

图16二氯喹啉酸在财塘段水样中的消解曲线图。

图17二氯喹啉酸在铁卢湖水样中的消解曲线图。

图18二氯喹啉酸在南雄水样中的消解曲线图。

图19二氯喹啉酸在夫子段水样中的消解曲线图。

图20二氯喹啉酸在辽宁阜新灭菌土壤中的消解曲线图。

图21二氯喹啉酸在云南玉溪灭菌土壤中的消解曲线图。

图22二氯喹啉酸在云南易门灭菌土壤中的消解曲线图。

图23辽宁土样中微生物PLFAs分布图。

图24易门土样中微生物PLFAs分布图。

图25玉溪土样中微生物PLFAs分布图。

图26 3种土壤中细菌、真菌、放线菌特征性磷脂脂肪酸含量比较图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。下述实施例仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。除非特别说明，下述实施例中使用的试剂为常规市购或商业途径获得的试剂，除非特别说明，下述实施例中使用的方法和设备为本领域常规使用的方法和设备。

实施例1 为验证本发明技术方案的准确性，本实施例以以下试验进行说明：

一、供试药剂及仪器

1.主要仪器

1100HPLC(美国Agilent公司)；DHZ-D恒温振荡培养箱(国产，广州深华生物技术有限公司)；DL-4000B冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；德国Sartorious电子天平BS 210S；PHS-3C精密pH计(上海雷磁仪器厂制造)；501数显恒温水浴锅(江苏宏华仪器厂)；RE 52-99旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；气质联用仪(石英毛细管柱，氢火焰离子检测器)；灭菌锅；超净工作台；

LRH-300-Gb光照培养箱(广东鑫腾科普仪器有限公司)；

2.主要试剂

99.5％二氯喹啉酸标准样品(国家农药质检中心生产，广东省农科院农化研究中心提供)。甲醇(一级色谱纯)；乙酸(分析纯)；四硼酸钠(分析纯)；正己烷(色谱纯)；甲基丁基醚(色谱纯)。

二、二氯喹啉酸在不同土样及水样中的残留降解动态分析

1.二氯喹啉酸添加处理

将99.5％二氯喹啉酸标准品按照推荐田间施用量0.65mg/kg均匀喷施于直径为17cm、高13cm大小一致的花盆中的土壤，并充分搅拌均匀，放入温室内并保持土壤湿润。设三个重复。分别于施药前、施药后1、2、6h及1、2、4、8、16、40、80、120、160d采集土样，每盆取土样50g，混匀后取其中50g土样进行残留检测前处理。水样制备：将二氯喹啉酸标准溶液按照0.65mg/L加入50mL水样中，每个处理设三个重复。

2.土壤样品前处理

0.05mol/L硼砂缓冲液50mL浸泡振荡1h、高速离心20min(6000r/min)，取上清液过0.45μm滤膜，HPLC测定。

3.色谱分析条件

色谱柱：HP ODS Hypersil 5μm，4.0×250mm；流动相：甲醇：1％乙酸水溶液(体积比为60/40)；流速：1mL/min；检测波长为：240nm；进样量：10μl。4.方法质控措施

分析测定质量控制与保证措施：①空白样：每批分析样需带1个空白样，以确认试剂及容器的清洁程度；②平行样：每批分析样需带2～3个平行样(20％)，以确认测试结果的再现性。

三、土壤中微生物对二氯喹啉酸残留降解的影响

1.二氯喹啉酸在灭菌土壤中的降解动态

土壤灭菌处理：向灭菌处理组土壤样品中加入10mL 0.2％的氯化汞溶液进行化学灭菌。

2.土壤磷脂脂肪酸(PLFAs)生物标记分析法

取未灭菌土样15g置于50mL离心管中，加入15mL0.2mol/L的KOH甲醇溶液，振荡5min，并于37℃水浴温浴1h，每10min振荡1次，加入3mL1.0mol/L醋酸溶液中和pH值，充分摇匀。加入10mL正己烷，充分摇匀，800r/min下离心15min，取上层正己烷于玻璃试管中，吹氮气使溶剂挥发。在玻璃试管中加入1mL体积比为1：1的正己烷：甲基丁基醚溶液，充分溶解3～5min，转入GC小瓶，待测。

3.气质联用检测条件

二阶程序升高柱温：170℃起始，5℃/min升至260℃，而后40℃/min升温至310℃，维持90s；汽化室温度250℃，检测器温度300℃，载气为H₂(2mL/min)，尾吹气为N₂(30mL/min)；柱前压为68～95KPa，进样量1μl，进样分流比为100：1。

4.数据分析

以i15:0、a15:0、15:0、16:0、i16:0、16:1ω9、16:1ω7t、i17:0、a17:0、17:0、18:1ω7和cy19:0作为细菌的特征脂肪酸(齐鸿雁，2003)，18:1ω9c可作为真菌的特征脂肪酸。特征峰名为10Me 17:0的是放线菌PLFAs主要的生物标记之一(Pankhurst,et al,2001)。PLFA1中的参考文献革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之比(G+/G-)则通过i15:0、a15:0、i16:0及i17:0脂肪酸物质的量之和与cy17:0、16:1ω9及cy19:0脂肪酸物质的量之和的比值来估。

5.三种土壤中微生物数量分析

土壤细菌采用营养琼脂培养基，土壤真菌采用孟加拉红马丁氏培养基，土壤放线菌采用高氏一号改良培养基。采用平板涂布法，每皿接种100μl，置于恒温培养箱中培养。细菌于37℃培养，真菌、放线菌于28℃培养。5天后观察并计数。选出细菌和放线菌菌落数在20～400之间和真菌菌落数在10～100的培养皿计数。每克干样品含菌数(cfu)＝菌落平均数×稀释倍数/样品克数

五、不同土壤样品烟草种植安全期的确定

将二氯喹啉酸药液分别喷施于待处理的土壤中，使处理土壤中二氯喹啉酸的含量为5个浓度梯度：0.65mg/kg，0.33mg/kg，0.17mg/kg，0.085mg/kg，0.0425mg/kg，0.02mg/kg移栽入生长状况相似的健康烟苗，每天定期观察烟苗的生长情况，并记录。

根据不同土壤样品的二氯喹啉酸残留消解公式，计算得到在二氯喹啉酸添加量为0.65mg/kg时，不同土壤样品中的二氯喹啉酸消解到安全种植浓度的时间，即安全种植烟草的间隔期。

六、结果与分析

(一)标准曲线、检出限、精密度和回收率

准确称取标准品二氯喹啉酸，用甲醇配制一定浓度的二氯喹啉酸母液。再 用甲醇稀释配制成质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、25.0μg/mL系列标准液，在上述色谱操作条件下分别进样1μL，以浓度为x轴、峰面积为y轴绘出标准曲线。二氯喹啉酸在0.1～25μg/mL的质量浓度范围内呈线性关系，线性方程为Y＝75.907x-5.0077，相关系数为0.9999。最小检出量为1.0×10^-9g，在土壤中的最低检出质量浓度均为0.01mg/kg，样品不同浓度加标回收率在90.81％～93.27％之间(表1所示)，变异系数在2.8％～5.0％之间。表明本实施例采用的样品提取。净化方法的平均回收率和变异系数满足残留实验要求。

表1 二氯喹啉酸在土壤中的回收率和精密度

注：-代表样品空白为未检出；最低检出质量浓度为0.01mg/kg。

(二)氯喹啉酸在不同生态条件下的残留降解动态

二氯喹啉酸多种来源不同的供试土壤及水样中的降解趋势见图3～19，二氯喹啉酸在供试土壤及水样中的降解动态基本上遵循一级动力学方程，即：Ct＝C₀e^－kt，t_1/2＝ln2/k。表2中列出了随机抽取的土壤样品中二氯喹啉酸残留消解方程的参数，在样品中二氯喹啉酸的残留量Ct与降解时间t之间的相关系数r均在0.87以上。样品中二氯喹啉酸的半衰期范围为48.6d～66.7d。

表2 二氯喹啉酸在土壤样品中的残留降解结果

(三)土壤微生物对二氯喹啉酸残留降解的影响

1.二氯喹啉酸在灭菌土壤和未灭菌中的降解动态

实验总结发现，没有经过杀菌处理的土壤样品中二氯喹啉酸的降解速率高于灭菌处理的土壤样品。二氯喹啉酸在灭菌和未灭菌处理土壤中的半衰期可见表3所示，二氯喹啉酸在灭菌土壤中的消解方程见图20、图21、图22所示。

以辽宁阜新、云南易门、云南玉溪三种土壤为例说明如下：二氯喹啉酸在灭菌与未灭菌两种处理的土壤样品中降解速率为：辽宁阜新(未灭菌，t1/2＝48.6d)>辽宁阜新(灭菌，t1/2＝610.27d)；云南易门(未灭菌，t1/2＝55.7d)> 云南易门(灭菌，t1/2＝616.76d)；云南玉溪(未灭菌，t1/2＝66.7d)>云南玉溪(灭菌，t1/2＝751.71d)。可见，经过灭菌处理的土壤样品中二氯喹啉酸的降解速率高于未灭菌处理的土壤样品。

表3 二氯喹啉酸在灭菌与未灭菌处理土壤中的半衰期及消解方程相关系数

2.三种土壤中微生物多样性的磷脂脂肪酸(PLFAs)个数和相对含量

对3种土样辽宁、易门、玉溪中的土壤微生物进行磷脂脂肪酸生物标记法分析，结果表明，3种土样辽宁、易门、玉溪中土壤微生物PLFAs个数:玉溪(12)＜辽宁(15)＝易门(15)。3种土样中的土壤微生物PLFAs的相对含量：玉溪(73.33％)>辽宁(70.53％)>易门(70.18％)。

表4 三种土壤样品中微生物PLFAs种类和相对含量

注：i、a、cy和Me分别表示异、反异、环丙基和甲基分枝脂肪酸；w、c和t分别表示脂肪酸端、顺式空间构造和反式空间构造。

根据3种土壤样品中微生物PLFAs种类和相对含量的结果，比较得出：细菌含量：辽宁阜新﹥云南易门﹥云南玉溪；真菌含量：云南玉溪﹥辽宁阜新﹥云南易门；放线菌含量：云南易门﹥辽宁阜新＝云南玉溪，其中辽宁阜新与云南玉溪放线菌含量为0。

3.三种土壤中可培养微生物数量分析

用平板稀释法设定10^-3、10^-4、10^-5三个稀释浓度梯度，测定辽宁阜新、云南玉溪、云南易门三种土壤样品中的可培养微生物数量(即每克土壤样品含菌量)，真菌含菌量：云南玉溪＞辽宁阜新＞云南易门；细菌含菌量：辽宁阜新＞易门＞云南玉溪；放线菌含菌量：云南易门＞辽宁阜新＞云南玉溪，结果见表5。

表5 三种土壤样品的每克含菌数

4.土壤样品烟草种植安全期的确定

多次试验总结发现，在烟苗移栽后第十天，观察到0.65mg/kg、0.33mg/kg、0.17mg/kg、0.085mg/kg、0.0425mg/kg浓度处理的烟苗均出现不同程度的生长畸形状况，而0.02mg/kg浓度处理的烟苗并未出现生长畸形现象，所以安全种植烟草的二氯喹啉酸残留浓度为0.02mg/kg。

根据不同土壤样品及4种水样的二氯喹啉酸残留消解公式计算分析大量试 验总结，二氯喹啉酸添加量为0.65mg/kg时，土壤土壤样品及4种水样施用二氯喹啉酸(0.65mg/kg)安全种植烟草的间隔期范围为246.00～385.28d。

表6 不同来源土壤及灌溉水二氯喹啉酸残留安全种植烟草的间隔期

综合上述实验总结发现，没有经过灭菌处理的土壤样品中二氯喹啉酸的降解速率高于灭菌处理的土壤样品，土壤微生物对二氯喹啉酸的降解有明显的影响。根据不同土壤样品的二氯喹啉酸的半衰期，对其进行土壤微生物分析，并随机选取辽宁阜新、云南易门、云南玉溪3种土壤样品作为代表说明。二氯喹啉酸在3种土壤样品中的降解速率：辽宁阜新﹥云南易门﹥云南玉溪；而3种土样中土壤微生物PLFAs个数:玉溪(12)＜辽宁(14)＜易门(15)；土壤微生物PLFAs的相对含量:玉溪(73.33％)>辽宁(67.53％)>易门(65.11％)。未发现土壤微生物的种类与相对含量对二氯喹啉酸的降解有明显的影响。

实施例2 残留二氯喹啉酸的植烟土壤安全种植方法。

在烟苗移栽前采用色谱法或生物测定等方法，对植烟土壤中残留的二氯喹 啉酸浓度进行检测，若检测浓度不大于0.02mg/kg，则进行烟苗移栽种植。在移栽后的第20天持续观察烟株生长情况，有必要的情况下，可对种植烟苗的土壤进行常规的杀菌处理，没有发现烟叶畸形情况的发生。

若检测浓度大于0.02mg/kg，则每隔48.6～66.7天再检测一次二氯喹啉酸浓度，直至检测到浓度不大于0.02mg/kg时再进行烟苗移栽种植，期间不进行杀菌处理。在移栽后的第20天持续观察烟株生长情况，有必要的情况下，可对种植烟苗的土壤进行常规的杀菌处理，没有发现烟叶畸形情况的发生。

若检测浓度大于0.02mg/kg而小于0.65mg/kg，则每隔48.6～66.7天再检测一次二氯喹啉酸浓度，期间不进行杀菌处理，在246天内检测到浓度不大于0.02mg/kg时再进行烟苗移栽种植。在移栽后的第20天持续观察烟株生长情况，有必要的情况下，可对种植烟苗的土壤进行常规的杀菌处理，没有发现烟叶畸形情况的发生。