薄荷油抗布氏田鼠生育的新方法与流程

本发明涉及用于控制害鼠布氏田鼠的环保型植物源抗生育灭鼠剂，具体的说是涉及一种以薄荷油为主要成分的雌性不育剂用于控制害鼠布氏田鼠繁殖，主要涉及薄荷油通过影响布氏田鼠胚胎着床，降低布氏田鼠胚胎着床的数目以此来控制其繁殖的新方法。

背景技术：

草地既是我国重要的农牧业自然资源，又是我国重要的生态屏障。草地鼠害是草地开发利用过程中出现的严重生态学问题。近30年来，我国草地鼠害发生面积呈现出逐年扩增的趋势，据统计1987-2012年之间，每年农田害鼠发生面积在0.2~ 0.4亿hm2，鼠害造成的牧草损失超过60亿元。草原鼠害的大规模发生，导致草场土壤肥力下降，水份大量流失，草地的生产力降低，造成杂草滋生及草地沙漠化，严重影响着草原畜牧业发展，也对农牧民的生存和发展构成威胁。

目前，草原鼠害防治方法主要分为化学灭鼠、物理灭鼠、生物灭鼠等，而草原灭鼠仍主要使用化学灭鼠剂来防治害鼠。化学灭鼠剂具有造成二次中毒，产生抗药、耐药以及环境污染等一系列严重问题，已经不能满足现代农业、畜牧业发展的要求。随着科学技术突飞猛进及环保意识普遍加强，寻找一种绿色环保的控制鼠类数量的方法迫在眉睫，而生物源性抗生育剂因为其具备特异性高、资源丰富、无环境污染，对生态环境影响小且能有效控制害鼠等优点在现代农业、畜牧业的害鼠生物防治上展现出了广阔的应用前景，也受到了国内外研究者的广泛关注。

薄荷油为唇形科植物薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）的新鲜茎和叶经水蒸气蒸馏、冷冻、部分脱脑加工提取的挥发油。主要活性成分为左旋薄荷醇(menthol)，含量达62%～87% ，广泛分布于北半球的温带地区，在我国广布于南北各省。药理实验表明薄荷油具有祛痰、利胆、解痉、抗炎镇痛、抗菌抗病毒、促渗透和抑制中枢神经系统等多方面的药理作用，且国内外有文献报道薄荷油对小鼠和家兔均有抗早孕、抗着床和抑制子宫收缩等作用，也有研究者通过灌胃处理发现薄荷油可明显降低老鼠的受孕率。作为一种潜在的新型植物源抗生育剂，薄荷油具有产量高、来源广、价格低廉、毒副作用小等优点，在农业、林业及畜牧业的鼠害防治方面，展现出了广阔的应用前景。

布氏田鼠（Brandt's Vole）分布于中国内蒙古中东部地区，黑龙江，吉林，辽宁，河北等地，以及蒙古国中部与东部和与其接壤的俄罗斯外贝加尔南部边界一带，主要栖息于植被退化的草场上，是内蒙古草原主要鼠害之一。目前，对于薄荷油对布氏田鼠的抗生育效果研究还尚未见到相关报道，本研究采用不同浓度薄荷油对布氏田鼠进行抗生育作用实验进行探究，并对抗生育作用机理进行分析，期望筛选出安全环保、无污染、可对害鼠种群数量实现可持续控制作用的新型植物源性抗生育剂。

技术实现要素：

本发现主要是发现了一种植物源型新药材对布氏田鼠具有显著的抗生育效果，旨在对草原害鼠布氏田鼠的繁殖率、数量进行控制，为其防治提供一种环保型新方法。

本发现通过以下技术方案实现。

本发现是用从唇形科植物薄荷中提取得到的挥发油薄荷油对怀孕布氏田鼠进行口服/灌胃处理，结果发现薄荷油能够明显降低布氏田鼠的胚胎着床数目，从而降低害鼠布氏田鼠的繁殖率，控制其繁殖数量。然后用组织病理学的研究方法对薄荷油对布氏田鼠的抗生育效果进行进一步探讨。薄荷油是一种环保型、对环境不会造成破坏，为鼠害的防控提供了一种新思路。

1药物材料及实验动物

专利所用实验材料为薄荷油, 实验用布氏田鼠捕捉自内蒙古自治区, 皆为幼鼠，在实验室内以鼠笼盒子雌雄分开喂养至性成熟，自然光照，室温，通风良好，供以充足的鼠粮及水，选择健康，达到性成熟的雄鼠及无怀孕迹象的雌鼠备用，正式实验前预饲养一周，观察实验布氏田鼠采食和饮水有无异样。

2 急性毒性实验方法

依据预实验所得到的实验数据，将备用布氏田鼠分为分为6组，每组6只，雌雄各半，分别为1个空白对照组和5个染毒剂量组，将实验用薄荷油用0.5%羧甲基纤维素钠配置成不同浓度薄荷油浓度，分别为0mg/kg、4000mg/kg、6000mg/kg、8000mg/kg、12000mg/kg、16000mg/kg，空白对照组以同体积的0.5%羧甲基纤维素钠代替，将各组老鼠于实验室内自然光照，室温，通风良好，供以充足的鼠粮及水的条件下喂养一周，观察各组实验用布氏田鼠有无异常，如无异常，于一周后的第一天早上9点对各组布氏田鼠按照预先设定的薄荷油浓度进行灌胃，自灌胃时刻起的7天内，观察实验用布氏田鼠的死亡情况，统计数据，分析结果。根据得到实验数据，利用改良寇氏法公式，薄荷油对布氏田鼠的急性毒性剂量LD50为 5314mg/kg。

3 抗生育效果研究

依据薄荷油对布氏田鼠的急性毒性实验所得到的数据，按照等比数列的方法设置各个薄荷油给药浓度，将实验备用的布氏田鼠雌雄分开进行一周喂养，观察布氏田鼠采食和饮水有无异常，然后按照雌雄2:1的比例进行合笼，次日早上进行妊娠检查（阴栓检查法）根据检查结果确认已受孕为妊娠第一天（D1），将受孕田鼠分为5组，每组12只，分别为三个薄荷油药物处理组（用0.5%羧甲基纤维素钠将薄荷油配置成预先设计的三个浓度剂量）、一个阳性对照组（用0.5%羧甲基纤维素钠将炔雌醚配置成预先设计浓度剂量）、一个空白对照组（以同样的方法给予相同体积的0.5%羧甲基纤维素钠），灌胃剂量为0.2ml/10g，自D1起分别对各剂量组于每天早上9:00进行经口灌胃给药，连续给药7天（D7），第10天（D10）解剖检验，统计各组胚胎数量、称量子宫及各脏器的重量，计算出各组胚胎平均数量并用spss软件对数据进行统计学分析，统计实验组与各对照组的胚胎着床是否有统计学差异，以P<0.05为有统计学意义。抗生育结果表明：与空白对照组相比，经薄荷油灌胃处理的布氏田鼠子宫胚胎数目随著薄荷油浓度的增大而显著降低，且差异显著，薄荷油浓度的高低对布氏田鼠子宫胚胎着床数目的影响呈现一定的剂量依赖性。

4 组织保存

将实验解剖所得到的布氏田鼠子宫组织部分保存于动物组织RNA保护液，部分保存于组织固定液（4%多聚甲醛）中带回实验室，再将其转移到冰箱中保存备用，进行下一步实验探究。

5 HE染色研究

用HE染色实验对布氏田鼠的子宫组织进行病理组织学组织形态观察。实验结果表明：空白对照组的布氏田鼠子宫内膜、肌层及外膜结构均清晰可见，子宫组织无病理学增生，而经过薄荷油药物处理的布氏田鼠的子宫结构图中，子宫内膜腔上皮的厚度明显增加，腺体增多，间质细胞明显减少，子宫腔上皮有损伤，明显的组织病理学增生。

6 扫描电子显微镜检视（SEM）

用SEM扫描电镜技术对布氏田鼠子宫组织子宫内膜表面进行观察，主要是对子宫内膜表面微绒毛及胞饮突进行观察分析。相比较于空白对照组，经药物处理过的布氏田鼠的子宫内膜表面胞饮突大量减少、子宫内膜表面已部分遭到破坏，子宫内膜容受性是指内膜对胚胎的接受能力，内膜遭到损害，子宫内膜容受性也必然相应的受到了影响。

7免疫组织化学实验分析

用免疫组织化学染色实验技术对布氏田鼠子宫中相关蛋白的表达进行分析，结果表明：子宫内的ERα主要在腔上皮、腺体细胞和基质细胞中广泛表达，相较于空白对照组，经薄荷油处理过的布氏田鼠子宫内ERα的表达水平显著降低；子宫内的PR也广泛分布在腔上皮细胞、腺体细胞和间质细胞中，在腺体细胞中的表达相对较少，在子宫腔上皮细胞中的表达相较于间质细胞和腺体细胞更有优势，与空白对照组的布氏田鼠相比，薄荷油处理组的布氏田鼠子宫内的表达水平也呈现显著下降的趋势；从图中可以看到，MMP2在子宫内的腔上皮、腺体细胞和间质细胞中都广泛表达，相较于空白对照组，MMP2在经薄荷油处理过的布氏田鼠子宫内的表达水平明显下调；从图上可以看出，E-cadherin同一时期在子宫内的表达相对较弱，且主要分布在腔上皮和腺体细胞中，间质细胞中基本不表达，相较于空白对照组，薄荷油药物处理组的子宫内的MMP2表达水平明显上调。

本发现与现有技术相比具有以下优点。

1 薄荷油属于植物源性中药材，其健康、生态、来源广泛、且能有效降低布氏田鼠的胚胎着床数目，薄荷油的使用不会对环境造成污染、二次中毒等相关问题。

2 我国草地鼠害发生面积呈现出逐年扩增的趋势，給草原生态、畜牧业发展及人类的生活等带来了各种各样的严重问题，布氏田鼠是内蒙古草原主要鼠害之一，而薄荷油能够通过影响布氏田鼠的胚胎着床过程从而影响其生育过程，这是一个可观的发现，也为草原鼠害的防治提供了一种新方法。

附图说明

图1图2 薄荷油对怀孕布氏田鼠胚胎着床数目的影响

A:空白对照组布氏田鼠胚胎着床情况；B：经过薄荷油药物处理的布氏田鼠胚胎着床数目减半；C：经过薄荷油药物处理的布氏田鼠胚胎着床数目大量减少；D：经过薄荷油药物处理的布氏田鼠无胚胎着床; E:不同浓度薄荷油药物处理对布氏田鼠胚胎着床平均数目的影响.

图3 薄荷油对布氏田鼠子宫内膜结构的影响

A:空白对照组布氏田鼠子宫内膜结构HE染色图; B:薄荷油处理组布氏田鼠子宫内膜结构HE染色图，Ge:腺体细胞; Le:腔上皮细胞；S：间质细胞，比例尺为10μm.

图4 薄荷油对布氏田鼠子宫内膜表面的影响（2000×）

C：空白对照组布氏田鼠子宫内膜表面电镜图；D：薄荷油药物处理组布氏田鼠子宫内膜表面电镜图。

图5图6 薄荷油对布氏田鼠子宫内相关蛋白表达水平的影响。

具体实施方式

下文将通过实施实例对本发明做进一步说明，但实施实例不以任何方式限制本发明。

实例1：

选用薄荷油为不育剂，以合笼交配成功的雌性布氏田鼠小鼠为研究对象，以750mg/kg/day的剂量连续灌胃给药7天，发现胚胎着床平均数量与对照组相比明显减少,胚胎着床数目减少了50%。

实例2：

选用薄荷油为不育剂药物，以合笼交配成功的雌性布氏田鼠为研究对象，以1000mg/kg/day的剂量连续灌胃给药7天，发现胚胎着床平均数量与对照组相比明显减少, 胚胎着床数目减少了57%。

实例3：

选用薄荷油为不育剂药物，以合笼交配成功的雌性布氏田鼠为研究对象，以1500mg/kg/day的剂量连续灌胃给药7天，发现胚胎着床平均数量与对照组相比显著减少胚胎着床数目减少了63%，且具有显著的统计学意义（P<0.05）。