一种甘蓝型油菜CMS恢复系的快速批量选育方法与流程

本发明属于油菜育种技术领域，具体涉及一种快速批量选育CMS恢复系的育种方法。

背景技术：

我国幅员辽阔，自然条件复杂多样，甘蓝型油菜种植区域跨度很大。从播种时期分为春油菜区(春播区)和冬油菜区(秋播区)，而冬油菜区又根据气候类型和特点分为4个大区，包括长江上、中、下游和黄淮区。不同生态区光照、温度、水分、土壤等条件差别很大，而甘蓝型油菜对光照、温度、水分等气候条件较为敏感，同一品种在不同生态区的表现差别很大。

目前国内种质资源保护手段有限，出于单位自身利益考量，各育种单位之间种质资源交流、合作育种等很难进行，加上长期的自然进化和人工选择，不同单位所拥有的种质资源，大多仅适于本生态区，导致跨区域品种选育难度大、效率低，限制了我国油菜产业的发展。目前为了跨区域品种选育，有实力的单位在目标推广区域建立育种基地，但这对人力、物力、财力要求较高，一般单位很难做到。另外，油菜自身的性状遗传具有一定的保守性，对一个育种单位而言，其所拥有的种质资源，要适应新的目标生态区，即使在该区域建立育种基地，还需要一个漫长的驯化和选育过程。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种快速批量选育CMS恢复系的育种方法，旨在解决目前国内种质资源保护手段有限，出于单位自身利益考量，各育种单位之间种质资源交流、合作育种等很难进行，加上长期的自然进化和人工选择，不同单位所拥有的种质资源，大多仅适于本生态区，导致跨区域品种选育难度大、效率低，限制了我国油菜产业发展的问题。

本发明是这样实现的，一种甘蓝型油菜细胞质雄性不育系(CMS)恢复系的快速、批量选育方法,包括如下步骤：

1)以长江上、中、下游和黄淮区国审的18个甘蓝型油菜CMS三系杂交品种等量混合做为聚合亲本；

2)当年秋播，把聚合亲本按1:2行比种植在隔离网室，行比1的做父本，行比2的做母本；

3)在蕾苔期，利用化学杂交剂“SX-1”诱导母本产生雄性不育；

4)在油菜花期，通过人工辅助授粉，使母本充分授粉结实，成熟时仅收取母本种子，做为下一个轮回的亲本；

5)重复步骤2)到步骤4)，直至进行4个世代的轮回；

6)把经过4个世代轮回产生的聚合群体秋季播种，第2年花期，选用该群体正常可育植株主花序和上部分枝上长度3.5-4.0mm的花蕾，以0.5mmol/L的秋水仙碱加倍染色体48小时，通过小孢子培养获得双单倍体(DH)分离群体。

7)把该DH分离群体中正常可育的株系分别种植在4个不同生态区，依据各生态区的育种目标进行表现型选择，同时和CMS不育系测交进行基因型鉴定，最终选育出一批分别适应长江上、中、下游和黄淮区的优良CMS恢复系。

进一步,所选择的聚合亲本来自于4个不同生态区域，均为国内多个育种单位选育的优良国审品种，囊括了不同生态区域、不同育种单位的众多优良性状基因。

进一步,18个CMS三系杂交种等量混合构成的聚合亲本，其基因型为S(R,r)，经过4个世代聚合重组产生新的聚合群体；花期取聚合群体正常植株的花蕾经小孢子培养获得的DH分离群体，不育株系直接淘汰；正常株系分别种植在4个生态区，依据各生态区育种目标进行表现型选择符合育种目标的优良株系与CMS不育系进行测交。。

进一步,把获得的DH分离群体分别放在4个不同生态区进行表现型选择，选育出的新的CMS恢复系，必然符合该生态区域的育种目标。

进一步,利用化学杂交剂“SX-1”诱导母本产生雄性不育，其技术要求如下：

1)在油菜蕾苔期，母本苔高20cm，主花序最大花蕾长2mm左右时，利用化学杂交剂“SX-1”涂抹油菜茎干，诱导母本产生雄性不育。由于18个品种生育期进程并不一致，所以在蕾苔期，对母本行满足要求的植株逐个进行涂茎处理。

2)涂茎诱导方法：吸取“SX-1”原液用食用油配成浓度为5.5-6.5mg/L的药液，用毛笔涂抹在油菜茎干上，涂抹位置距离地面10cm左右，涂抹长度5cm左右。

本发明方法所构建的聚合亲本，来自于冬油菜区4个不同生态区域，13个育种单位，且均为国审优良品种，包含有众多适于不同生态区域的优良性状基因。借助化学诱导雄性不育技术，进行4个世代的聚合重组，各优良品种进行了充分的互交，众多优良性状基因进行了充分的聚合重组，从而产生了一个拥有众多新的优良性状基因的聚合群体。通过小孢子培养获得的DH分离群体，放在4个不同生态区进行性状选择和基因型鉴定，最终选育出一批分别适于各自生态区域的优良CMS恢复系。

与传统跨区育种方法相比，本发明方法具有以下优势：1)目标针对性强、效率高，所构建的聚合群体自身就包含有4个目标生态区的优良性状基因，最终选育出的是一批适于各自生态区的优良CMS恢复系，这对于加速跨生态区育种进程、提高育种效率具有极其重要的意义。2)该方法中优良性状基因虽然来自于国内多个育种单位，但均为公开发售的国审优良品种，不存在资源交流和品种权纠纷问题，对选育的优良CMS恢复系，本单位拥有完全知识产权。

附图说明

图1是本发明实施例提供的CMS恢复系选育图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明目的在于提供一种快速批量选育甘蓝型油菜CMS恢复系的方法。与传统跨区域品种选育相比，利用该方法选育甘蓝型油菜CMS恢复系目标性更强、效率更高，并且不存在资源交换和品种权纠纷问题。

如图1所示，本发明通过以下技术方案实现：一种甘蓝型油菜CMS恢复系的快速批量选育方法，包括如下步骤：

1)以长江上、中、下游和黄淮区国审的18个甘蓝型油菜CMS三系杂交品种(见附表)等量混合做为聚合亲本；

2)当年秋播，把聚合亲本按1:2行比种植在隔离网室，行比1的做父本，行比2的做母本；

3)在蕾苔期，利用化学杂交剂“SX-1”诱导母本产生雄性不育；

4)在油菜花期，通过人工辅助授粉，使母本充分授粉结实，成熟时仅收取母本种子，做为下一个轮回的亲本；

5)重复步骤2)到步骤4)，直至进行4个世代的轮回；

6)把经过4个世代轮回产生的聚合群体秋季播种，第2年花期，选用该群体正常可育植株主花序和上部分枝上长度3.5-4.0mm的花蕾，以0.5mmol/L的秋水仙碱加倍染色体48小时，通过小孢子培养获得双单倍体(DH)分离群体。

7)把该DH分离群体中正常可育的株系分别种植在4个不同生态区，依据该生态区的育种目标进行表现型选择，同时和CMS不育系测交进行基因型鉴定，最终选育出一批分别适应长江上、中、下游和黄淮区的优良CMS恢复系。

18个CMS三系杂交种等量混合构成的聚合亲本，其基因型为S(R,r)，经过4个世代聚合重组产生的新的聚合群体，理论上其不育植株S(r,r)占1/4，正常植株S(R,R)和S(R,r)共占3/4。花期取聚合群体正常植株花蕾经小孢子培养获得的DH分离群体，理论上不育株系S(r,r)占DH群体总数的1/3，恢复株系S(R,R)占2/3。在油菜花期，不育株系直接淘汰；正常可育株系分别种植在长江上、中、下游和黄淮区，依据各生态区育种目标进行表现性选择；符合育种目标的株系与CMS不育系进行测交，能够恢复CMS不育系育性的株系即为恢复系。

更具体的技术方案如下所述：

1、利用化学杂交剂“SX-1”诱导母本产生雄性不育，其技术要求如下：

1)在油菜蕾苔期，母本苔高20cm，主花序最大花蕾长2mm左右时，利用化学杂交剂“SX-1”涂抹油菜茎干，诱导母本产生雄性不育。由于18个品种生育期进程并不一致，所以在蕾苔期，对母本行满足要求的植株逐个进行涂茎处理。

2)涂茎诱导方法：吸取“SX-1”原液用食用油配成浓度为5.5-6.5mg/L的药液，用毛笔涂抹在油菜茎干上，涂抹位置距离地面10cm左右，涂抹长度5cm左右。

2、油菜小孢子培养方法：

1)油菜小孢子的分离提取

在油菜初花一周内，取轮回群体正常可育植株主花序和上部分枝花序上长度为3.5-4.0mm的花蕾(用生物显微镜抽检小孢子发育是否处于单核晚期)用蒸馏水冲洗干净；在超净工作台上先用70％酒精灭菌30s，再用20％次氯酸钠灭菌15min，然后用无菌水冲洗3次；取灭菌好的花蕾放入B5培养基中研磨成匀浆；用300目双层尼龙网过滤，10ml离心管收集滤液，经800rpm离心5min，吸去上清液，加入液体B5培养基悬浮小孢子，再离心，重复3次，吸去上清液。

2)染色体加倍

在上述离心管中加入含有0.5mmol/L秋水仙碱的NLN-13培养基，悬浮小孢子，并分装于150ml三角瓶中(每瓶40-45个花蕾，20-25ml培养液)，用灭菌的尼龙纸封口，32℃暗培养48h。

3)小孢子培养

将经过上述处理的溶液1000rpm离心5min，吸取上清液，去除秋水仙碱，并加入无激素的NLN-13培养基悬浮洗剂和离心1次，最后加入含6-BA0.05mg/L、NAA0.5mg/L的NLN-13培养基悬浮小孢子，接着将小孢子溶液分装于直径为7.5cm的无菌培养皿中，每皿7.5ml(每皿约5-6个花蕾)，Parafilm封口，在32℃的水浴恒温培养箱中暗培养24h，然后转移至25℃的水浴恒温培养箱中培养。当肉眼可见胚时，将培养皿转移至摇床上，在25℃下40-60rpm暗培养7d。7d后改用较大的培养皿和含有ABA0.3mg/L的NLN-13培养基在25℃条件下40-60rpm摇床光照培养。以后用相同的培养条件每7d继代1次，直到胚发育成熟，并长出完整的子叶，分化成苗后将其转移至含有6-BA0.5mg/L的B5固体培养基上进行继代和增殖，适时移栽至大田。

附表：本发明轮回亲本所用品种名录

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。