一种人工辅助授粉缓解高温对水稻颖花育性伤害的方法与流程

本发明属于农作物抗热减灾栽培技术领域，更具体涉及一种人工辅助授粉缓解高温对水稻颖花育性伤害的方法，该方法可应用于水稻大田生产，在水稻遭受花期高温时利用该技术可以有效降低高温导致的产量损失。

背景技术：

人类活动导致气候变暖，地表温度增加。IPCC(2014)报告表明过去100年间全球地表面平均温度升高了0.85℃，预计21世纪末地表气温将比1850–1900年间升高1.0–3.7℃。生长季高温一般不利于水稻产量形成，极端高温天气则严重影响我国水稻高产、稳产，例如我国长江流域2003年7–8月份出现的持续、极端高温天气对水稻产量造成了严重损失。未来极端高温事件出现的频率表现出增加的趋势，将严重威胁我国水稻生产，因此缓解高温对水稻伤害的合理、有效措施在保障国家粮食安全方面具有重要意义。

抽穗扬花期是水稻高温最敏感的时期之一，该时期高温主要通过影响颖花育性而降低水稻产量。水稻颖花育性由花药开裂、花粉育性和胚囊育性共同决定，但是胚囊育性对高温的反应不如雄性花器敏感，高温对颖花育性的影响主要在于花药开裂和花粉育性。正常条件下，水稻柱头上需要保证＞10萌发的花粉粒才能保证胚囊顺利受精，而保证＞10颗萌发的花粉粒的必要条件是柱头上散落＞20颗花粉粒，高温条件下花粉萌发率降低，为保证足量的花粉萌发则要求柱头上接受更多的花粉数。然而，高温导致柱头接受的花粉数和花粉萌发数降低正是其限制水稻颖花育性的主要因素，高温一方面抑制了花药开裂，并引起花粉粒黏连成团，不利于花粉粒散落，导致柱头上接受的花粉数不足，对柱头授粉造成不利影响；另一方面，高温抑制柱头上的花粉萌发及萌发花粉粒花粉管伸长等过程而影响胚囊受精，最终导致颖花育性下降。因此，促进花药开裂、花粉散落和柱头花粉粒萌发的方法是缓解花期高温对水稻颖花育性伤害的关键技术。

花药开裂及散粉除了受基因遗传控制外也受到外界物理刺激的影响，如人为触碰、风等物理干扰会促进正在开放的颖花中花药开裂及花药内花粉散落。因此，在缓解水稻授粉障碍方面，可以利用人工辅助赶粉促进花药散粉，对缓解高温对水稻授粉的不利影响具有较大的潜力。矿质元素(如Ca²⁺，K⁺)、生长调节物质(如植物激素，多胺)和糖类物质促进花粉萌发及花粉管伸长，如内源激素参与诱导花粉萌发和花粉管伸长，蔗糖具有为花粉萌发提供能量和作为渗透调节物质的双重作用，Ca²⁺和K⁺调节花粉粒吸水膨胀和引导花粉管向胚囊延伸。高温通过破坏组织内离子平衡、影响生长调节物质含量和减缓糖代谢等生理过程而阻碍花粉萌发和花粉管伸长。因此，在缓解水稻受粉障碍方面，可以通过施用矿物质、生长调节物质或糖类物质维持组织内各化学物质间的平衡，减轻高温对花粉粒生理活动的不利影响，从而缓解高温对花粉萌发和花粉管伸长的伤害。本发明研究的目的就是利用人工辅助授粉的措施，通过人工赶粉并配合喷施化学调控剂的方法以缓解高温对水稻颖花育性的伤害。

技术实现要素：

针对花期高温对水稻授粉的不利影响而导致的颖花不育，本发明的目的是在于提供了一种人工辅助授粉缓解高温对水稻颖花育性伤害的方法。该方法先通过人工赶粉促进花药开裂和花粉散落，提高了柱头上接受的花粉数，缓解了高温对授粉的不利影响，然后对赶粉的植株喷施化学调控剂以促进柱头上的花粉萌发，提高了胚囊受精的几率，最终提高了花期高温处理下水稻的颖花育性，保证了水稻花期遭受高温时产量的稳定。

为了实现上述的目的，本发明采用如下技术方案：

一种人工辅助授粉缓解高温对水稻颖花育性伤害的方法，其步骤是：

(1)配制化学调控剂：配制总体积为1L的化学调控剂溶液，分别称取100g蔗糖、0.1g硼酸、0.111g氯化钙、0.236g硝酸钙、0.0745g氯化钾、0.3g酶水解酪蛋白、0.1g肌醇、0.1g柠檬铁胺、0.0145g亚精胺、1.031gγ-氨基丁酸和0.5×10^-3g 2,4-表油菜素内酯溶入100ml纯水中，然后转移至1000ml容量瓶中定容至刻度并摇匀，pH调至7.8–8.2于4℃环境下冷藏，喷施前滴1-2滴Tween-20(Tween，为聚氧乙烯去水山梨醇单月桂酸酯和一部分聚氧乙烯双去水山梨醇单月桂酸酯的混合物)；

(2)进行人工赶粉：在水稻两优培九，汕优63开花当日分别在09:30-11:00用竹竿进行3－5次人工赶粉，赶粉时用竹竿轻轻敲击水稻穗部促使花粉散落。赶粉关键时刻在盛花的时候，一般在开花当日的10:00-10:30，此时合理、有效的赶粉可以最大程度的提高花粉有效利用率，促进水稻柱头授粉；

(3)化学调控剂施用：在每次赶粉结束后立即对两优培九和汕优63稻穗喷施一次化学调控剂(步骤1所述)，按6–8(ml/株/次)的用量喷施，均匀喷施使穗部颖花表面呈薄雾状，喷施化学调控剂一方面可以促进花粉萌发，另一方面可以保证柱头湿润，促使更多的花粉粒粘附在柱头上，有助于高温(平均温度28.6–31.5℃)下柱头授粉。

本发明与现有技术相比，具有以下效果和优点：

花期高温不利于柱头授粉，降低水稻颖花育性，导致水稻产量显著下降。赶粉和赶粉并喷施化学调控剂均不同程度提高各温度处理下水稻的颖花育性，赶粉和赶粉并喷施化学调控剂对缓解高温对两优培九、汕优63颖花育性伤害的效果比对照温度下的更明显。对照温度(T0:27.6℃)条件下，与空白处理相比，赶粉并喷施化学调控剂使两优培九和汕优63的颖花育性分别增加了4.9％和3.7％。高温(T1:28.6℃、T2:29.2℃和T3:31.5℃)条件下，与自然授粉处理(无人工辅助授粉)比，赶粉并喷施化学调控剂使两优培九和汕优63的颖花育性分别增加了4.9％和3.7％；白天高温条件下，人工辅助授粉对颖花育性的效果更明显，其中28.6℃，29.2℃，31.5℃下赶粉使两优培九和汕优63的颖花育性分别提高了5.4％、16.6％、61.1％和2.4％、7.1％、12.0％，赶粉并喷施化学调控剂使两品种的颖花育性分别提高了15.8％、33.8％、133.0％和6.7％、10.7％、28.6％。该技术可实时操作，灵活应对水稻花期高温伤害。

附图说明

图1为一种对照、高温及对照和高温下赶粉处理对花药散粉的表现示意图。

图2为一种人工辅助授粉技术对水稻品种两优培九花药散粉影响的示意图。

A为对照温度下水稻花药散粉的表现；B为对照温度下赶粉对花药散粉的影响；C为对照温度下赶粉并喷施化学调控剂对花药散粉的影响；D为高温处理下水稻花药散粉的表现，该图显示高温不利于水稻花药散粉，大量花粉残留在花药内部；E为高温处理下赶粉处理对花药散粉的影响，该图显示高温下赶粉处理后花药内无花粉粒残留；F为高温处理下赶粉并喷施化学调控剂处理对花药散粉的影响，该图显示显示高温下赶粉并喷施化学调控剂处理后花药内无花粉粒残留，说明高温可通过影响花粉散落而限制了授粉，赶粉处理可以人为的促进花粉散出，从而为水稻正常授粉创造有利条件。

图3为一种人工辅助授粉技术对水稻品种两优培九和汕优63柱头授粉影响的示意图。

A,G分别为两优培九和汕优63柱头接受花粉数及花粉萌发数在对照温度下的表现；B,H分别为对照温度下人工赶粉对两优培九和汕优63柱头接受花粉数及萌发花粉数的影响；C,I分别为对照温度下人工赶粉并喷施生长调节物质对两优培九和汕优63柱头接受花粉数及花粉萌发数的影响；D,J：分别为两优培九和汕优63柱头接受花粉数及萌发花粉数在高温下的表现；E,K分别为高温下人工赶粉对两优培九和汕优63对柱头接受花粉数及萌发花粉数的影响；F,L分别为高温下人工赶粉并喷施生长调节物质对两优培九和汕优63柱头接受花粉数及萌发花粉数的影响。

具体实施方式

实施例1：

一种人工辅助授粉缓解高温对水稻颖花育性伤害的方法，其步骤是：

1、材料与方法：

试验于2014年5月-10月在华中农业大学植物科技学院盆栽场进行，以两个对花期高温耐性不同的杂交稻品种汕优63(耐高温)和两优培九(高温敏感)为材料，始穗时搬入人工生长室(4m×4m×4.5m)开始处理。设置T0，T1，T2，和T3四种温度处理(图1)，室内通过自动控温系统(AUTO-Greenhouse monitoring and data management system,Auto,Beijing)控制温度。

化学调节剂配制：配制总体积为1L的生长调节混合物溶液，分别称取100g蔗糖、0.1g硼酸、0.111g氯化钙、0.236g硝酸钙、0.0745g氯化钾、0.3g酶水解酪蛋白、0.1g肌醇、0.1g柠檬铁胺、0.0145g亚精胺、1.031gγ-氨基丁酸和0.0005g 2,4-表油菜素内酯溶入100ml纯水中，然后转移至1000ml容量瓶中定容至刻度，将混合液pH调至7.8–8.2，于4℃下储藏待用。

2、人工辅助授粉：

2.1、人工赶粉：在水稻品种两优培九和汕优63开花当日分别于09:30,10:00,10:30和11:00用竹竿进行4次人工赶粉，赶粉时用竹竿轻轻敲击水稻穗部促使花粉散落。水稻盛花的时候(10:00-10:30)花粉量最大，为赶粉的关键时刻，此时进行合理、有效的赶粉可以最大程度的提高花粉利用率，促进水稻柱头授粉；

2.2、化学调控剂施用：每次人工赶粉结束后对两优培九和汕优63稻穗喷施一次化学调节剂(pH＝8.0的溶液中含10％蔗糖、1mM氯化钙、1mM硝酸钙、1mM氯化钾、0.01％硼酸、0.01％肌醇、0.1mM亚精胺、0.01％柠檬铁胺、10mMγ-氨基丁酸、0.03％酶水解酪蛋白和1uM2,4-表油菜素内酯)，确保喷出液为细雾状，建议按6-8(ml/株/次)的用量喷施。

3、水稻授粉、产量及产量构成因子测定：

3.1、花药开裂，柱头授粉与柱头花粉萌发：

高温处理第3天取样测定，取样前一天挂牌标记翌日即将开放的稻穗，第一次人工辅助授粉处理后(09:30)对挂牌稻穗取样调查、统计花药开裂情况，重复4次，每次取挂牌稻穗上总计60朵当日开花的花药于光学显微镜下观察统计花药开裂情况。花药一端或两端开裂视为开裂，两端均未开裂视为未开裂，花药开裂率＝开裂花药数/镜检花药数×100％。

15:00取挂牌稻穗上的6朵当日开放的颖花(上、中、下各2颖花)于FAA固定液(38％甲醛，乙酸，70％乙醇＝5:5:90)中用于柱头制片观察，重复4次。观察时取出颖花依次置于70％、50％、30％和10％的酒精溶液中复水，再置于蒸馏水中清洗2次，剥出柱头置于预先加1–2滴苯胺蓝溶液(100ml的0.1mol/L K₃PO₄含0.1g水溶性苯胺蓝)的载玻片上并压片，黑暗条件下静置10min后于荧光显微镜下观察拍片，统计水稻柱头上接受的花粉总数和萌发的花粉总数，柱头花粉萌发率＝柱头萌发花粉数/柱头接受花粉总数×100％。

3.2、产量及产量构成因子：

生理成熟期取主茎考察产量及产量构成因子，重复4次，每重复考察3主茎。稻穗脱粒后通过先水选、再风选的方法将颖花分为饱粒、半饱和空粒3部分，分别统计并计数。饱粒于80℃下烘干至恒重，作为主茎产量。总颖花数＝饱粒数+半饱数+空粒数，颖花育性＝(饱粒数+半饱粒数)/总颖花数×100％，粒重＝产量/饱粒数。

4、试验结果分析：

表1结果显示，对照温度(T0:24.8–31.8℃)和三种高温处理(T1:24.6–34.3℃；T2:24.1–35.9℃；T3:25.7–38.3℃)的日平均温度分别为27.6,28.6,29.2,31.5℃，表明高温处理下的温度均超过水稻花期最适温度(26–28℃)。此外，水稻植株遭受高温时若伴随高湿还会使高温伤害加剧，温室内各处理下的相对湿度(81.2％–82.3％)高达80％以上，本实例属于高温、高湿环境。

表1.处理温(℃)、湿度(％)

注：白天07:00-19:00；夜间19:00-次日07:00

高温处理使水稻品种两优培九和汕优63的花药开裂率显著下降(表2)，大量花粉残留在花药内部(图2-D)，柱头上接受的花粉数减少(表2；图3-D,J)，说明高温一方面阻碍或延迟了水稻的花药开裂，另一方面不利于水稻药室内花粉脱离，最终导致散粉障碍，从而影响柱头授粉。高温引起花药内部水分代谢及其它生理活动紊乱，致使大量花粉粒沾黏成团，可能是高温导致散粉障碍的生理原因。总之，高温对花药开裂及散粉的不利影响导致了柱头授粉障碍。

赶粉处理一方面可以提高花药开裂率(表2)，另一方面有助于花药内残留的花粉粒脱离药室(图2-B,E)，从而为水稻正常授粉创造有利条件。对柱头的考察结果表明，赶粉对柱头授粉有明显的促进作用，其中对照温度和高温处理条件下，赶粉处理均可以明显提高柱头上接受的花粉数(图3-B,E,H,K)，柱头花粉萌发数也有所增加，说明赶粉处理可以有效缓解高温对水稻授粉的不利影响。人工赶粉有助于花粉散落，该方法一方面促进花药开裂，另一方面振落残留于花药内部的花粉粒，再者还可以驱使附着在颖壳、叶片等组织上的花粉粒弹起，从而提高水稻授粉过程中稻穗空间范围内的花粉密度，增加水稻柱头授粉(自交或异交)的几率。化学调控剂的施用可以诱导花粉萌发，由本发明在高温下应用的结果可知，赶粉后追喷生长调节剂同时有效提高了各温度处理下柱头接受的花粉数和柱头萌发的花粉数(表2；图3-C,F,I,L)，从而缓解了高温对水稻授粉的不利影响，在应对高温对水稻颖花育性伤害方面具有较大的潜力。

表2.人工辅助授粉对水稻花药开裂及柱头接受和萌发花粉数的影响

LYPJ：两优培九；SY63：汕优63；NAP：空白处理；ADP：赶粉处理；AMP：赶粉并喷施化学调控剂

产量和颖花育性考察的结果表明，与对照温度相比，水稻品种两优培九和汕优63的产量随花期温度增加而显著下降，该时期高温主要降低水稻颖花育性而降低水稻产量(表3)。通过赶粉和赶粉并喷施化学调控剂的应用，可以不同程度提高各温度处理下的水稻颖花育性。对照温度条件下，赶粉及喷施化学调控剂处理下两优培九和汕优63的颖花育性分别提高了4.9％和3.7％。高温条件下，赶粉和赶粉并喷施化学调控剂对水稻的颖花育性的效果更明显，且温度越高颖花育性的提高越趋于显著，其中T1，T2，T3下赶粉对两优培九和汕优63颖花育性的增幅分别为5.4％、2.4％，16.6％、7.1％和61.1％、12.0％，赶粉并喷施化学调控剂对两品种颖花育性的增幅分别为15.8％、6.7％，33.8％、10.7％和133.0％、28.6％(表3)。因此，人工辅助授粉能够不同程度提高各温度下的水稻颖花育性，从而提高了水稻产量，缓解花期高温对水稻的不利影响。

表3.人工辅助授粉对水稻产量及产量构成因子的影响

LYPJ：两优培九；SY63：汕优63；NAP：空白处理；ADP：赶粉处理；AMP：赶粉并喷施化学调控剂。