将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法
【专利摘要】本发明提供了一种将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法，包含以下步骤：在颖壳颜色决定基因OsCAD2外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体，导入水稻细胞并再生成苗，在通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位OsCAD2基因同时发生功能缺失突变的株系，经过表型鉴定，实现颖壳颜色的改变。实验表明，本方法可快速改变水稻品种的颖壳颜色。
【专利说明】将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水稻生物技术育种领域，具体涉及一种将现有黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改良为褐色的育种方法。
【背景技术】
[0002]我国的杂交水稻制种技术经过30多年的研究发展，不仅制种技术成熟，而且，制种产量也成倍提高，为我国主要农作物产量的持续提高起到了关键作用。但是，杂交水稻制种技术仍然存在制种效率不高，劳动强度大，种子质量难以控制，种子产量不稳定等问题。解决这些问题的有效路径是实现全程机械化的混播制种。由于混播制种中存在父母本和杂交亲本的混收混种，需要适当的标记区分杂交种子和亲本。目前，水稻颖壳的颜色被认为是最具实用化前景的区分标记之一，因此发展快速改造水稻品种颖壳颜色的育种技术将有效促进杂交水稻混播制种技术的发展。
[0003]水稻颖壳颜色的遗传机理目前已部分明确。非常规水稻颖壳颜色主要包括深金黄色(褐色)和黑色，其表现的性状受到不同的基因调节。0sCAD2是一种可单独控制水稻颖壳颜色的基因。0sCAD2编码一种肉桂醇脱氢酶，可催化裂解羟基肉桂醛，是木质素合成途径中的关键步骤。已有报道表明，籼稻品种浙辐802的突变体gh2中，0sCAD2基因第四外显子中第554位的G突变为A，造成0sCAD2蛋白中相应的甘氨酸变为天冬氨酸，引起肉桂醇脱氢酶活性的丧失，从而引起gh2突变体的颖壳颜色变褐；而在粳稻品种日本晴中，反转座子Tosl7插入造成0sCAD2表达提前终止，也造成了同样颖壳颜色加深的性状。
[0004]现代作物育种中，存在针对单个性状的改良需求。这个时候，已杂交-回交为基础的传统育种的聚焦能力略显不足，且育种周期长、成本也很高。与之不同，分子生物学技术，特别是最近发展出的基因打靶技术可以快速准确的为单基因的变化提供有效解决方案。特别是2013年起发展出的CRISPR/Cas9技术，具有高通量、操作简单等优良特点，将在分子设计育种中发挥重要作用。
【发明内容】
[0005]本发明提供了一种将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
[0006]步骤1、在水稻颖壳颜色决定基因0sCAD2外显子区中选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶标片段，其中，N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，所述靶标片段位于所述0sCAD2基因外显子上；
[0007]步骤2、利用所述靶标片段，构建用于水稻0sCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框；
[0008]步骤3、将所述重组载体导入水稻细胞，诱导含有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，在向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框的共同作用下，剪切0sCAD2基因的双链靶标片段，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现水稻细胞内OsCAD2基因的功能缺失突变；
[0009]步骤4、用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株；
[0010]步骤5、对再生的水稻植株中0sCAD2基因包含靶标片段的DNA区段测序；
[0011]步骤6、选择两个等位0sCAD2基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型观察，选取颖壳颜色变褐的株系。
[0012]在一种实现方式中，所述祀标片段中的一条链具有5’ _(N)x-NGG-3’结构，(N)x表示数目为X的一条碱基序列(N1, N2……NJ，N1, N2……Nx中的每一个表示A、G、C、T中的任意一个。
[0013]在一种实现方式中，X为19或20。
[0014]进一步地，所述功能缺失突变为正常0sCAD2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
[0015]在一种实现方式中，所述重组载体包含能够在水稻细胞内表达的向导RNA表达框，其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，所述重组载体还包含能够在水稻细胞内表达的Cas9核酸酶表达框，其核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
[0016]在一种实现方式中，所述向导RNA表达框包括:水稻U6启动子,其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示； 结构特征为(N)x的靶标序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第351至358位所示。
[0017]在一种实现方式中，所述Cas9核酸酶表达框包括玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示，植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq IDN0.2第6347至6599位所示。
[0018]在一种实现方式中，步骤2具体包括:按照靶标序列的核酸排列顺序，构建用于水稻0sCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体。向导RNA表达框由CRISPR RNA(crRNA)和sgRNA组成(对于不同位点的基因打靶来说，SgRNA是固定不变的，而CrRNA是根据靶位点的不同变化的)。所述重组载体中CRISPR RNA(crRNA)序列为步骤I中所述靶标区段5’-(N)X-NGG-3’中的(N)x或与之互补的序列。
[0019]该方法中，将重组载体导入水稻细胞的方法为PEG介导的水稻原生质体瞬时转化或农杆菌介导的水稻愈伤组织稳定转化。
[0020]所述步骤5包括通过基因组PCR方法克隆再生植株中0sCAD2基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。所述基因组PCR方法为，针对包含靶标片段的基因组区域，设计位点特异性引物，以再生植株的基因组DNA为模板，扩增所述包含靶标片段的基因组区域。所述扩增产物测序是指，对PCR产物中的目的条带测序。
[0021]该方法中所述两个等位0sCAD2基因都出现功能缺失突变是指测序结果在0sCAD2基因靶标位点出现两种功能缺失突变序列，且没有出现野生型序列；其中所述功能缺失突变指的是正常0sCAD2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
[0022]本发明能够通过对特定基因的剪切，实现基因突变，进而改变颖壳颜色。本发明针对水稻的特性专门设计了向导RNA和Cas9核酸酶表达框，来实现本发明的目的。
[0023]本发明一种实现方式中所米用的向导RNA表达框的核苷酸序列为:[0024]
【权利要求】
1.一种将黄色颖壳的水稻品种的颖壳颜色改为褐色的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 步骤1、在水稻颖壳颜色决定基因0SCAD2外显子区中选取以碱基NGG结尾的DNA片段作为靶标片段，其中，N代表碱基A、G、C、T中的任意一种，所述靶标片段位于所述OsCAD2基因外显子上； 步骤2、利用所述靶标片段，构建用于水稻OsCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，其中所述重组载体中包含具有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框； 步骤3、将所述重组载体导入水稻细胞，诱导含有所述靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，剪切OsCAD2基因的双链靶标片段，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现水稻细胞内OsCAD2基因的功能缺失突变； 步骤4、用导入所述重组载体的水稻细胞再生若干水稻植株； 步骤5、对再生的水稻植株中OsCAD2基因包含所述靶标片段的DNA区段测序； 步骤6、选择两个等位OsCAD2基因都出现功能缺失突变的再生株系，进行表型观察，选取颖壳颜色变褐的株系。
2.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述靶标片段中的一条链具有5，- (N) x-NGG-3， 结构，(N) x表示数目为X的一条碱基序列{N” N2......Nj，N1, N2......Nx中的每一个表不A、G、C、T中的任意一个。
3.根据权利要求2所述的育种方法，其特征在于，X为19或20。
4.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述功能缺失突变为正常OsCAD2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
5.根据权利要求1所述的育种方法，其特征在于，所述重组载体包含能够在水稻细胞内表达的向导RNA表达框,其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示,所述重组载体还包含能够在水稻细胞内表达的Cas9核酸酶表达框，其核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
6.根据权利要求5所述的育种方法，其特征在于， 所述向导RNA表达框包括:水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；结构特征为(N)x的靶标序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqID N0.1第267至350位所示；以及Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第351至358位所示。
7.根据权利要求5所述的育种方法，其特征在于， 所述Cas9核酸酶表达框包括玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示，植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所示。
【文档编号】C12N15/82GK103981212SQ201410210447
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】魏鹏程, 杨剑波, 李莉, 宋丰顺, 马卉, 倪金龙, 秦瑞英, 李 浩, 陆徐忠, 杨亚春 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所