一种创制闭颖授粉水稻材料的育种方法
【专利摘要】本发明涉及一种创制闭颖授粉水稻材料的育种方法，包含以下步骤：在水稻闭颖授粉决定基因DEP2外显子区选取靶标片段并构建植物CRISPR/Cas9打靶重组载体，导入水稻细胞并再生成苗，通过剪切造成水稻细胞DEP2基因出现功能缺失突变，在通过对再生株系基因组目标片段的测序，获取携带两个等位DEP2基因同时发生功能缺失突变的株系，经过表型鉴定，确认再生植株开花授粉由开颖转为闭颖。实验表明，本方法可快速获得闭颖授粉水稻材料。
【专利说明】一种创制闭颖授粉水稻材料的育种方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水稻生物技术育种领域，具体涉及一种快速创制闭颖授粉水稻材料的
选育方法。
【背景技术】
[0002]基因漂移(或基因逃逸，Gene flow)，是指一种生物的目标基因向附近野生近缘种自发转移，导致附近野生近缘种发生内在变化，具有目标基因的一些优势特征，形成新物种，以致整个生态环境发生结构性的变化。根据转基因漂移对象的不同，可以分为转基因作物的外源基因向其非转基因作物、野生近缘种和同一物种的杂草类型逃逸。基因漂移的途径主要包括花粉漂移、种子传播(或扩散)和无性繁殖器官的移动等。基因漂移一般需要一定的媒介，如风、昆虫、动物和水等，其中风媒和虫媒传粉是最为有效的方式，而花粉也可以产生长距离的漂移
[0003]闭花受精(cleistogamy)是在花朵未开放时成熟花粉粒在花粉囊内萌发,花粉管穿出花粉囊，伸向柱头，进入子房，把精子送入胚囊，完成受精。被子植物(60个科约300种植物)中广泛存在着闭花受精现象。栽培作物中，大豆、豌豆属于严格的闭花受精作物，水稻、大麦、棉花、高梁中也存在闭花受精类型。闭花受精能使植物避免外来花粉干扰而保持纯种，也可以防止自身花粉向外漂移。因此，闭花受精可作为控制基因漂流的途径之一。
[0004]水稻是典型的开花授精(开颖授粉)的作物。但目前有一些研究分离了部分表现为闭颖性状的水稻突变体 ，如:单个隐性基因d7决定CL突变体的表型(不正常的护颖，使外颖和内颖结合在一起)；单个隐性基因Id (t) [lodiculeless spikelet (t)]突变产生衆片缺失突变体，颖壳不张开；水稻直立穗基因DEP2突变能产生严格的闭颖授粉性状。
[0005]虽然闭颖材料品种在水稻转基因育种方面具有广阔的应用前景，但是天然的遗传突变资源有限，应用存在一定的技术难度。通过传统的回交导入技术，育种周期漫长，成本较大，且可能导入与突变位点连锁的其他供体基因组片段，对品种选育带来不可预知的风险。因此，人们希望获得一种能够快速定向创制闭颖授粉水稻材料的方法。
【发明内容】
[0006]针对上述问题，本发明提供了一种创制闭颖授粉水稻材料的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤:
[0007]步骤1，在水稻闭颖授粉决定基因DEP2的第一、第二或第三外显子区选取靶标片段；
[0008]其中，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、G、C中的任意一种；
[0009]步骤2，按照靶标序列的核苷酸排列顺序，构建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框包含所述靶标片段；[0010]步骤3，将所述重组载体导入水稻细胞，使所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，剪切DEP2基因的双链的所述靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内DEP2基因的功能缺失突变；
[0011]步骤4，用导入所述重组载体的水稻细胞再生植株；
[0012]步骤5，对所述再生植株中DEP2基因包含靶标片段的DNA区段进行测序；
[0013]步骤6，选择两个等位DEP2基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的开花习性，挑取完全闭颖授粉的植株，作为所创制的闭颖授粉水稻材料。
[0014]优选地，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有5’ _(N)x-NGG-3’结构，其中，
(N) X表不数目为X的一条碱基序列{N” N2......Nj，N1, N2......Nx中的每一个表不A、G、C、T
中的任意一个，NGG中的N也代表A、G、C、T中的任意一个。X—般为19或20。
[0015]优选地，所述重组载体包含向导RNA表达框，其能够在水稻细胞内表达并且核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，并且所述重组载体包含Cas9核酸酶表达框，其能够在水稻细胞内表达并且核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。也可以说，另一方面本发明还提供了这种重组载体。
[0016]优选地，所述向导RNA表达框包括:水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；结构特征为(N)x的靶标序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第266至349位所示；和Poly-T终止子,其核苷酸序列如Seq ID N0.1第350至357位所示，
[0017]所述Cas9核酸酶表达框包括:玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示；植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所示。
[0018]优选地，所述向导RNA表达框包括CRISPR RNA (crRNA)序列，其具有所述靶标片段的5’ -(N)x-NGG-3，中的(N)x或与之互补的序列。
[0019]在所选的DEP2基因外显子上，具有所述(N)X-NGG_3’结构的片段可选为靶标的共有35个。
[0020]步骤6中所提到功能缺失突变指的是正常DEP2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
[0021]所述Cas9核酸酶表达框位于包含所述向导RNA表达框的同一载体中。
[0022]在步骤3中将所获重组载体导入水稻细胞，从而使细胞同时含有步骤所述靶标片段的向导RNA，Cas9核酸酶。在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，DEP2基因的双链靶标片段被剪切，再通过水稻细胞自身的DNA修复功能，最终实现细胞内DEP2基因靶标片段的随机插入和/或随机缺失。
[0023]所述方法中，将重组载体导入水稻细胞的方法为农杆菌介导的水稻愈伤组织稳定转化。由于在将所获重组载体导入水稻细胞的过程中，是采用农杆菌介导的方法，重组载体被导入到水稻的遗传DNA中，所以在进行剪切时使得水稻的遗传DNA的片段受到剪切。
[0024]在本发明中，所述再生植物的方法为细胞或组织经过组织培养，获得植株。[0025]在步骤5中，可以通过基因组PCR方法克隆再生植株中DEP2基因包含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序。所述基因组PCR方法为，针对包含靶标片段的基因组区域，设计位点特异性引物，以再生植株的基因组DNA为模板，扩增所述包含靶标片段的基因组区域。所述扩增产物测序是指，对PCR产物中的目的条带测序。
[0026]所述两个等位DEP2基因都出现功能缺失突变是指测序结果在DEP2基因靶标位点出现两种功能缺失突变序列，且没有出现野生型序列；
[0027]其中所述功能缺失突变序列指的是正常DEP2编码序列在靶标位点出现终止子或阅读框移位。
[0028]向导RNA表达框的核苷酸序列(Seq ID N0.1)如下所示:
[0029]ggatcatgaaccaacggcctggctgtatttggtggttgtgtagggagatggggagaagaaaagcccgattctcttcgctgtgatgggctggatgcatgcgggggagcgggaggcccaagtacgtgcacggtgagcggcccacagggcgagtgtgagcgcgagaggcgggaggaacagtttagtaccacattgcccagctaactcgaacgcgaccaacttataaacccgcgcgctgtcgcttgtgtgGCTCTCCCCGCGCCGCTCGgttttagagctatgctgaaaagcatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgctttttttt
[0030]Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列(Seq ID N0.2)如下所示:
[0031]ctgcagtgcagcgtgacccggtcgtgcccctctctagagataatgagcattgcatgtctaagttataaaaaattaccacatattttttttgtcacacttgtttgaagtgcagtttatctatctttatacatatatttaaactttactctacgaataatataatctatagtactacaataatatcagtgttttagagaatcatataaatgaacagttagacatggtctaaaggacaattgagtattttgacaacaggactctacagttttatctttttagtgtgcatgtgttctcctttttttttgcaaatagcttcacc tatataatacttcatccattttattagtacatccatttagggtttagggttaatggtttttatagactaatttttttagtacatctattttattctattttagcctctaaattaagaaaactaaaactctattttagtttttttatttaataatttagatataaaatagaataaaataaagtgactaaaaattaaacaaataccctttaagaaattaaaaaaactaaggaaacatttttcttgtttcgagtagataatgccagcctgttaaacgccgtcgacgagtctaacggacaccaaccagcgaaccagcagcgtcgcgtcgggccaagcgaagcagacggcacggcatctctgtcgctgcctctggacccctctcgagagttccgctccaccgttggacttgctccgctgtcggcatccagaaatgcgtggcggagcggcagacgtgagccggcacggcaggcggcctcctcctcctctcacggcacggcagctacgggggattcctttcccaccgctccttcgctttcccttcctcgcccgccgtaataaatagacaccccctccacaccctctttccccaacctcgtgttgttcggagcgcacacacacacaaccagatctcccccaaatccacccgtcggcacctccgcttcaaggtacgccgctcgtcctccccccccccccctctctaccttctctagatcggcgttccggtccatggttagggcccggtagttctacttctgttcatgtttgtgttagatccgtgtttgtgttagatccgtgctgctagcgttcgtacacggatgcgacctgtacgtcagacacgttctgattgctaacttgccagtgtttctctttggggaatcctgggatggctctagccgttccgcagacgggatcgatttcatgattttttttgtttcgttgcatagggtttggtttgcccttttcctttatttcaatatatgccgtgcacttgtttgtcgggtcatcttttcatgcttttttttgtcttggttgtgatgatgtggtctggttgggcggtcgttctagatcggagtagaattctgtttcaaactacctggtggatttattaattttggatctgtatgtgtgtgccatacatattcatagttacgaattgaagatgatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgcgggttttactgatgcatatacagagatgctttttgttcgcttggttgtgatgatgtggtgtggttgggcggtcgttcattcgttctagatcggagtagaatactgtttcaaactacctggtgtatttattaattttggaactgtatgtgtgtgtcatacatcttcatagttacgagtttaagatggatggaaatatcgatctaggataggtatacatgttgatgtgggttttactgatgcatatacatgatggcatatgcagcatctattcatatgctctaaccttgagtacctatctattataataaacaagtatgttttataattattttgatcttgatatacttggatgatggcatatgcagcagctatatgtggatttttttagccctgccttcatacgctatttatttgcttggtactgtttcttttgtcgatgctcaccctgttgtttggtgttacttctgcagcccgggggatccccaatacttgtatggccgcggccgctctagatggattacaaggaccacgacggggattacaaggaccacgacattgattacaaggatgatgatgacaagatggctccgaagaagaagaggaaggttggcatccacggggtgccagctgctgacaagaagtactcgatcggcctcgatattgggactaactctgttggctgggccgtgatcaccgacgagtacaaggtgccctcaaagaagttcaaggtcctgggcaacaccgatcggcattccatcaagaagaatctcattggcgctctcctgttcgacagcggcgag acggctgaggctacgcggctcaagcgcaccgcccgcaggcggtacacgcgcaggaagaatcgcatctgctacctgcaggagattttctccaacgagatggcgaaggttgacgattctttcttccacaggctggaggagtcattcctcgtggaggaggataagaagcacgagcggcatccaatcttcggcaacattgtcgacgaggttgcctaccacgagaagtaccctacgatctaccatctgcggaagaagctcgtggactccacagataaggcggacctccgcctgatctacctcgctctggcccacatgattaagttcaggggccatttcctgatcgagggggatctcaacccggacaatagcgatgttgacaagctgttcatccagctcgtgcagacgtacaaccagctcttcgaggagaaccccattaatgcgtcaggcgtcgacgcgaaggctatcctgtccgctaggctctcgaagtctcggcgcctcgagaacctgatcgcccagctgccgggcgagaagaagaacggcctgttcgggaatctcattgcgctcagcctggggctcacgcccaacttcaagtcgaatttcgatctcgctgaggacgccaagctgcagctctccaaggacacatacgacgatgacctggataacctcctggcccagatcggcgatcagtacgcggacctgttcctcgctgccaagaatctgtcggacgccatcctcctgtctgatattctcagggtgaacaccgagattacgaaggctccgctctcagcctccatgatcaagcgctacgacgagcaccatcaggatctgaccctcctgaaggcgctggtcaggcagcagctccccgagaagtacaaggagatcttcttcgatcagtcgaagaacggctacgctgggtacattgacggcggggcctctcaggaggagttctacaagttcatcaagccgattctggagaagatggacggcacggaggagctgctggtgaagctcaatcgcgaggacctcctgaggaagcagcggacattcgataacggcagcatcccacaccagattcatctcggggagctgcacgctatcctgaggaggcaggaggacttctaccctttcctcaaggataaccgcgagaagatcgagaagattctgactttcaggatcccgtactacgtcggcccactcgctaggggcaactcccgcttcgcttggatgacccgcaagtcagaggagacgatcacgccgtggaacttcgaggaggtggtcgacaagggcgctagcgctcagtcgttcatcgagaggatgacgaatttcgacaagaacctgccaaatgagaaggtgctccctaagcactcgctcctgtacgagtacttcacagtctacaacgagctgactaaggtgaagtatgtgaccgagggcatgaggaagccggctttcctgtctggggagcagaagaaggccatcgtggacctcctgttcaagaccaaccggaaggtcacggttaagcagctcaaggaggactacttcaagaagattgagtgcttcgattcggtcgagatctctggcgttgaggaccgcttcaacgcctccctggggacctaccacgatctcctgaagatcattaaggataaggacttcctggacaacgaggagaatgaggatatcctcgaggacattgtgctgacactcactctgttcgaggaccgggagatgatcgaggagcgcctgaagacttacgcccatctcttcgatgacaaggtcatgaagcagctcaagaggaggaggtacaccggctgggggaggctgagcaggaagctcatcaacggcattcgggacaagcagtccgggaagacgatcctcgacttcctgaagagcgatggcttcgcgaaccgcaatttcatgcagctgattcacgatgacagcctcacattcaaggaggatatccagaaggctcaggtgagcggccagggggactcgctgcacgagcatatcgcgaacctcgctggctcgccagctatcaagaaggggattctgcagaccgtgaaggttgtggacgagctggtgaaggtcatgggcaggcacaagcctgagaacatcgtcattgagatggcccgggagaatcagaccacgcagaagggccagaagaactcacgcgagaggatgaagaggatcgaggagggcattaaggagctggggtcccagatcctcaaggagcacccggtggagaacacgcagctgcagaatgagaagctctacctgtactacctccagaatggccgcgatatgtatgtggaccaggagctggatattaacaggctcagcgattacgacgtcgatcatatcgttccacagtcattcctgaaggatgactccattgacaacaaggtcctcaccaggtcggacaagaaccggggcaagtctgataatgttccttcagaggaggtcgttaagaagatgaagaactactggcgccagctcctgaatgccaagctgatcacgcagcggaagttcg
【权利要求】
1.一种创制闭颖授粉水稻材料的育种方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤: 步骤I，在水稻闭颖授粉决定基因DEP2外显子区选取靶标片段； 其中，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有NGG结构，其中N代表碱基A、T、G、C中的任意一种； 步骤2，按照靶标序列的核苷酸排列顺序，构建用于水稻DEP2基因打靶的CRISPR/Cas9重组载体，所述重组载体包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框,所述向导RNA表达框包含所述靶标片段； 步骤3，将所述重组载体导入水稻细胞，使所述向导RNA表达框和所述Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，剪切DEP2基因的双链的所述靶标片段，诱发所述水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点随机插入或缺失碱基，实现细胞内DEP2基因的功能缺失突变； 步骤4，用导入所述重组载体的水稻细胞再生植株； 步骤5，对所述再生植株中DEP2基因包含靶标片段的DNA区段进行测序； 步骤6，选择两个等位DEP2基因都出现功能缺失突变的再生植株，进行表型鉴定，观察所述再生植株的开花习性，挑取完全闭颖授粉的植株，作为所创制的闭颖授粉水稻材料。
2.根据权利要求1所述的创制闭颖授粉水稻材料的育种方法，其特征在于，所述靶标片段的双链结构中的一条链具有5’ _(N)x-NGG-3’结构，其中，(N)x表示数目为X的一条碱基序列(N1, N2......Nx}, N1, N2......Nx中的每一个表不A、G、C、T中的任意一个。
3.根据权利要求2所述的创制闭颖授粉水稻材料的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表达框能够在水稻细胞内表达并且核苷酸序列如Seq ID N0.1所示；所述Cas9核酸酶表达框能够在水稻细胞内表达并且核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
4.根据权利要求2所述的创制闭颖授粉水稻材料的育种方法，其特征在于，所述向导RNA表达框包括:水稻U6启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；结构特征为(N)x的靶标序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第266至349位所示；和Poly-T终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第350至357位所示， 所述Cas9核酸酶表达框包括:玉米ZmUBI启动子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示；植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS终止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所示。
5.根据权利要求3所述的创制闭颖授粉水稻材料的育种方法，其特征在于， 所述向导RNA表达框包括CRISPR RNA序列，其具有所述靶标片段的5’ _(N)X-NGG_3’中的(N)x或与之互补的序列。
6.根据权利要求3所述的创制闭颖授粉水稻材料的育种方法，其特征在于，所述靶标片段位于水稻闭颖授粉决定基因DEP2的第一、第二和/或第三外显子上。
【文档编号】C12N15/82GK103981211SQ201410209551
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年5月16日 优先权日:2014年5月16日
【发明者】倪大虎, 杨剑波, 魏鹏程, 马卉, 李 浩, 李莉, 倪金龙, 陆徐忠, 宋丰顺, 杨亚春 申请人:安徽省农业科学院水稻研究所