本发明属于植物室内无土栽培和繁殖方法，具体涉及冬季烟草室内加代繁育方法。
背景技术：
无土栽培是设施农业中的重要技术方法，利用营养液直接在水培装置中进行植物水培种植，或用基质栽培固定植物后用营养液进行滴灌、渗灌或浇灌，其具有生长环境条件可控、周年种植生产和经济效益高的优势，所以目前在蔬菜和花卉等经济价值较高的植物中应用较广泛。与此同时，利用水培技术和方法，可以开展植物营养和抗逆性的水培鉴定研究，其中水培技术用于植物材料耐盐性筛选(一种筛选甘薯耐盐突变体的方法，CN101002539A；筛选作物抗逆品系的方法，CN101385438A)等研究比较多，有关烟草水培技术主要是辅助的水培固定装置（组合式烟草水培烟株固定装置，CN201595055U）和烟草抗病性水培鉴定(一种烟草黑胫病抗性的苗期恒温水培鉴定方法CN101999287A；一种新的烟草黑胫病抗性快速鉴定方法，CN102498878A)，而综合利用无土栽培技术和剪叶处理控制植物生长，实现冬季烟草重要遗传材料在室内有限环境条件下进行加代繁育和生物学研究相对较少。
烟草和其他作物一样，为加快其繁育进程，一年需要种两季，冬天可在海南进行烟草育种材料的加代繁育，或利用具有可控光源和加热取暖设施的温室进行加代繁育。正常生长的烟株一般高120～150cm，按正常烟草栽培密度1100株/亩计算，单株烟占地~0.61m2；温室盆栽条件下，一块2.4m×0.73m的水泥平地可以摆16个花盆（上部直径32cm，底部直径25cm，高27cm），以供烟苗正常生长成熟，烟草单株温室占地~0.11m2。一般的遗传研究或遗传育种材料会有上百或上千株，需要大田栽培和冬天南繁，温室栽培可以控制光温条件，但日光温室建造成本和冬天运行成本高，而且普通栽培烟草不具有蔬菜、花卉等植物株型小和生育期短的生物学特性，所以在温室条件下只能种植少量烟株，使冬天温室加代繁育烟草在使用成本和实际可用面积上具有一定的局限性。
技术实现要素：
本发明基于普通烟草的生物学特性，综合利用水培和无土基质栽培技术，对烟草遗传材料进行水培和基质栽培，并且在其生长前期进行剪叶处理，抑制烟苗底部节间伸长，达到控制烟草株高和烟叶大小，以利于冬天在室内有限环境条件下进行大批量烟株的栽培与花药培养研究，代替冬天南繁加代的步骤和克服日光温室栽培的场地和成本限制。
本发明的突出特点是利用烟草的自然生长特性，结合水培和基质栽培，以及剪叶处理技术，控制烟草株高在35～65cm，节间长度1～2cm，中部烟叶长15～25cm，宽 8～12cm，株型显著减小，并且正常生长和开花结实，室内烟草单株占地0.03m2，相比大田单株占地面积，可提高空间利用率20.3倍，相比温室提高3.7倍，从而较大程度上提高室内烟草无土基质栽培的空间利用率，有利于冬季在室内大批量种植烟草遗传材料，开展花药培养等生物学研究工作。
为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
冬季烟草室内加代繁育方法，按如下步骤进行：
步骤1）烟草育苗
首先用0.9mm孔径筛子将蛭石过筛控制蛭石粒径大小，剔除其中比较大的蛭石，过筛后的蛭石装到耐高温的铁磁盘中，在烘箱中高温灭菌，待冷却后用蒸馏水浸润蛭石，将烟草种子撒播到蛭石育苗基质上，在光照培养箱内正常光照催芽；待烟苗长出2片真叶后备用；
步骤2）无土定植
将步骤1）中获得的长出2片真叶烟苗，移植在漂浮板上的定植孔中，再将漂浮板放在水培容器中并加入完全营养液，对烟苗进行水培至成苗期；
所述漂浮板选用1～1.5cm厚度的泡沫板，先将泡沫板裁剪成长56cm，宽37cm，然后在泡沫板上用直径1cm打孔器按一定行株距打定植孔，在打有定植孔的泡沫板背面用针线缝合固定上一块空隙比较小又利于根系扎入的纱网，制成漂浮板；
所述水培容器利用长×宽×高为59cm×39cm×14.5cm塑料周转箱，将其内壁用黑色塑料膜包裹，透明胶固定，制作成一个盛水防漏遮光的水培容器；
每1升所述完全营养液中含有：
浓度为1 mol/L的 KNO3溶液，5.0mL；
浓度为1 mol/L的MgSO4·7H2O 溶液，2.0 mL；
浓度为1 mol/L的KH2PO4溶液，1.0 mL；
浓度为1 mol/L的Ca（NO3）2·4H2O溶液，5 mL；
铁盐溶液，10 mL：每1升所述铁盐溶液由2.78 g的FeSO4·7H2O和3.72 g的EDTA·2Na混合制备而成；
还含有微量元素：H3BO3，2.86g；MnCL2·4H2O，1.81g；ZnSO4·7H2O，0.22g；CuSO4·5H2O，0.08g；H2MoO4·4H2O，0.09g；
余量为水；
步骤3）基质移栽培植
将蛭石装入小花盆中，小花盆依次排列放置在硬质纸盒水培容器中；将水倒入水培容器中，当硬质纸盒水培容器中的水浸透蛭石基质后，再倒入完全营养液；
再将步骤2）中成苗期的烟苗移栽到小花盆中后，将硬质纸盒水培容器移至光照室的培养架上光照培养，光照室温度25～28℃，光照时间10～12h，每7～14d换一次水和完全营养液的混合液，换混合液前栽培基质控水晾置1～2d，以利于根系生长；
在烟苗16～20叶期以前，每7～14d剪叶，剪掉中下部烟叶长度的2/3～1/2，以抑制节间伸长，而促进顶部烟叶生长；16～20叶期以后，停止剪叶，待烟株正常生长和开花结种子；利用花朵取花药可以开展花药培养试验，利用所结种子可以用于繁殖。
所述硬质纸盒水培容器是利用硬质纸盒箱在其内壁用黑色塑料膜包裹，并用透明胶固定，制作成一个盛水防漏遮光的水培容器；该水培容器长度控制在30～120cm，宽度控制在20～47cm，高度控制在5～15cm。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
冬季烟草室内加代繁育方法，按如下步骤进行：
步骤1）烟草育苗
首先用0.9mm孔径筛子将蛭石过筛控制蛭石粒径大小，剔除其中比较大的蛭石，过筛后的蛭石装到耐高温的方形铁磁盘（44cm×34cm）中，在烘箱中100℃高温灭菌，待冷却后用蒸馏水浸润蛭石，将烟草种子K326、B21、F1(K326/B21)和F1(B21/K326）（烟草种子由湖北烟草科研所提供）撒播到蛭石育苗基质上，在光照培养箱（25℃～28℃）内正常光照催芽；待烟苗长出2片真叶后备用。
步骤2）无土定植
将步骤1）中获得的长出2片真叶烟苗，移植在漂浮板上的定植孔中，再将漂浮板放在水培容器中并加入完全营养液，用稀盐酸调节完全营养液pH在6.5；对烟苗进行水培至成苗期。
所述漂浮板选用1cm厚度的泡沫板，先将泡沫板裁剪成长56cm，宽37cm，然后在泡沫板上用直径1cm打孔器按一定行株距打定植孔，在打有定植孔的泡沫板背面用针线缝合固定上一块空隙比较小又利于根系扎入的纱网，制成漂浮板。
所述水培容器利用长×宽×高为59cm×39cm×14.5cm塑料周转箱，将其内壁用黑色塑料膜包裹，透明胶固定，制作成一个盛水防漏遮光的水培容器。
选用K326、B21、F1(K326/B21)和F1(B21/K326）烟苗开展钾胁迫对比试验
取上述4～5叶期烟苗，先用自来水冲洗根部蛭石，再把烟苗根系直接放到定植孔中，每个遗传材料在两个水培漂浮板上各定植2行，在完全营养液中先缓苗一周；缓苗后，在一个水培容器中加入完全营养液（见发明内容部分），另一个水培容器中加入缺钾营养液，每周换一次营养液；三周后调查不同烟草遗传材料的叶形（长和宽）、根长、烟株鲜重等指标，统计结果见表1；
上述实验结果显示：相比对照正常处理，在钾胁迫条件下，不同遗传材料各指标均明显降低或减小，其中叶片大小和地上重影响较大，两个品种正反杂交材料对钾胁迫的响应程度存在一定差异，说明部分胞质效应影响烟草对钾胁迫的响应。
每1升所述缺钾营养液中含有：
浓度为5 mol/L的NH4NO3溶液，0.5 mL；
浓度为3 mol/L的NaH2PO4·2H2O溶液，0.33 mL；
浓度为1 mol/L的MgSO4·7H2O 溶液，2.0 mL；
浓度为1 mol/L的Ca（NO3）2·4H2O溶液，5 mL；
铁盐溶液，10 mL：每1升所述铁盐溶液由2.78 g的FeSO4·7H2O和3.72 g的EDTA·2Na混合制备而成；
还含有微量元素：H3BO3，2.86g；MnCL2·4H2O，1.81g；ZnSO4·7H2O，0.22g；CuSO4·5H2O，0.08g；H2MoO4·4H2O，0.09g；
余量为水。
步骤3）基质移栽培植
将蛭石装入小花盆中，小花盆依次排列放置在硬质纸盒水培容器中；将水倒入水培容器中，当硬质纸盒水培容器中的水浸透蛭石基质后，再倒入完全营养液。
再将步骤2）中成苗期的烟苗移栽到小花盆中后，将硬质纸盒水培容器移至光照培养室的培养架上光照培养，设定温度25～28℃，光照时间10～12h，每7～14d换一次完全营养液，换营养液前栽培基质控水晾置1～2d，以利于根系生长。
在烟苗16～20叶期以前，每7～14d剪叶，剪掉中下部烟叶长度的2/3～1/2，以抑制节间伸长，而促进顶部烟叶生长；16～20叶期以后，停止剪叶，待烟株正常生长和开花结种子；剪叶处理的烟株，一般在基质栽培3～4个月后，烟株高35～45cm ，中部烟叶长15～25cm，宽8～12cm，并且每个花序正常开花6～8朵，由于烟草种子繁殖系数高，可以满足正常的留种，以备开春播种繁育。
所述硬质纸盒水培容器是利用硬质纸盒箱在其内壁用黑色塑料膜包裹，并用透明胶固定，制作成一个盛水防漏遮光的水培容器；该水培容器长度控制在30～120cm，宽度控制在20～47cm，高度控制在5～15cm。
步骤4）烟草花药培养
选取F1(B21/K326)和F1(K326/B21) 遗传材料开展花药培养构建烟草DH遗传群体；待F1(B21/K326)和F1(K326/B21)开花时，将花萼和花瓣等长的花朵全部剪下，放在湿润的纱布中，将其放入编有号码的一次性自封袋中，自封袋不封口，放在4℃冰箱中以备用；在无菌操作台上，用捻指将花药取出，放在灭菌的纱布上折叠包裹后在70%（v/v）酒精中消毒10s，然后在10%（m/v）次氯酸钙溶液中消毒5～10min，用灭菌蒸馏水浸洗2～3次后接种在烟草花药培养H培养基中；一个月后花药中长出单倍体苗，在其4～6叶期，取出单倍体苗用90mg/L的秋水仙素溶液处理48h，再用灭菌蒸馏水清洗后，转接到MS (Murashige and Skoog)培养基中成苗；然后在室内无土基质中栽培炼苗，温室移栽到土壤中。烟草在剪取花朵后，会刺激烟株腋芽的生长和成花，所以花药接种一个月后，烟株会长出新的花序，可以继续留种繁育。
表 1