一种昆虫病原线虫种群密度检测装置及检测方法与流程

本发明涉及一种昆虫病原线虫种群密度检测装置及检测方法，属于生物防虫技术领域。

背景技术：

昆虫病原线虫(entomopathogenic nematodes，EPNs)是一类专门寄生昆虫的线虫，通过3龄感染期幼虫对害虫身体的自然开口或节间膜侵入的方式进入寄主体内，并释放携带的共生细菌，使其在害虫体内繁殖，产生毒素，最终导致害虫死亡。因EPNs具有寄主范围广泛，主动寻找寄主，对非靶标生物安全，对环境无副作用，能与许多农药、肥料混用等优点，已广泛应用于防治蛴螬、地老虎、桃小食心虫、天牛等多种农林地下害虫。

在应用昆虫病原线虫防治害虫的过程中，如何有效地从土壤中获得适合于地方生态条件下的线虫品系是成功防治害虫的关键。此类工作目前主要采用大蜡螟(Galleria mellonella)活体诱集的方法，具体步骤为田间取土后，将土样分装在塑料盒内，再加入一定数量的大蜡螟幼虫进行诱集。这种方法需要经过大蜡螟感染、解剖以及线虫收集检测过程，费事费力，且此方法需要占用较大试验场地，花费大量时间来检查实验结果。因此极大地限制了线虫的野外收集。

另外，在田间应用线虫后，需要监测线虫在土壤的存活情况以便决定下一次应用的必要性、应用实践及用量。这一过程目前仍然采用大蜡螟活体诱集的方法，除以上的局限性外，田间取样势必破坏田间作物。

此外，昆虫病原线虫作为一种害虫生防因子，其优势之一在于不仅能够在害虫体内大量繁殖，而且可在土壤内长时间存活，具有调节害虫种群数量、持续控制害虫的能力。因此，如何获得不同时期内田间使用某种线虫品系的种群密度则是有效发挥线虫调节害虫种群数量、持续控制害虫的能力又一关键。此类工作目前主要采用分子检测手段，即通过实时荧光定量PCR的方法。此方法繁琐，且费用极高，不利于大面积的推广及应用。

如：中国专利文献CN101849534 A公开了一种昆虫病原线虫分离与检测装置，可用于土壤中昆虫病原线虫分离及种群密度测量。该装置虽然不破坏作物的正常生长，但该装置采用大蜡螟进行诱集，诱集时间长，并且线虫分离与密度检测装置分别进行，费时费力，在应用中存在很大的局限性，同时在实际应用中还存在诱集的线虫容易沿棉花逃离的缺陷。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种昆虫病原线虫种群密度检测装置及检测方法。

发明概述：

本发明针对线虫的收集及统计种群数量时，需要采集土样、调查大蜡螟感染情况、解剖虫体、破坏作用等所导致的费时费力的问题，提供一种昆虫病原线虫种群密度检测装置，该装置结构简单，诱集效率高，且线虫不容易逃离；通过该装置测试不同物质对线虫诱集能力的评价；评价韭蛆+韭菜根组合的韭蛆数量对诱集线虫的影响；明确韭蛆+韭菜根组合诱集线虫的最佳时间；以及检测器放置间距的优化；最终建立不同线虫浓度下的诱集线虫的标准曲线。该装置及方法可以应用在农业如粮食作物﹑油料作物、蔬菜作物等以及林业等多种模式下的线虫种群检测。同时也可以用在非耕地地块进行线虫种群检测。

本发明的技术方案如下：

一种昆虫病原线虫种群密度检测装置，该装置包括两层管状结构的采集管和捕捉管，采集管包括采集内管和采集外管两层，采集内管和采集外管两端均开口设置，采集内管的底端螺纹连接有诱集网罩，捕捉管位于采集外管的底端并与采集外管螺纹连接，诱集网罩位于采集外管内，捕捉管为上端开口、下端封闭的管状结构，环绕捕捉管的侧壁上设有2-3个诱集孔，在捕捉管内填充有清水，在捕捉管的内壁上设置有密封诱集孔的无纺布，并且无纺布的下端延伸至清水中。

本发明优选的，采集内管与采集外管之间的间距为2～10mm。通过无数次实验验证，采集内管与采集外管之间的间距对诱集效果最佳，间距过大，诱集得到的线虫数量少，间距过大，操作不方便并且线虫数量少。

本发明最为优选的，采集内管与采集外管之间的间距为4～5mm。

本发明优选的，采集管的顶端设置有密封塞将采集管密封并将采集内管和采集外管连接在一起。

本发明优选的，诱集网罩的高度为15～20mm，诱集网罩的内径与采集内管相匹配。

本发明优选的，捕捉管的高度为35～45mm，捕捉管的内径与采集外管相匹配。

本发明优选的，诱集网罩的底端距离诱集孔下端1～4mm，最为优选的，诱集网罩的底端距离诱集孔下端2mm。该距离既保证了最佳的诱集效果，又有效的防止诱集的线虫逃离。

本发明优选的，无纺布的下端延伸至清水的长度为4～7mm，最为优选的，无纺布的下端延伸至清水的长度为5mm。延伸的长度可以使线虫更容易通过无纺布中水分进行清水中，且进入清水后线虫再难于逃离到土壤中。

本发明优选的，采集管的高度5～60cm。采集管的高度满足采集不同深度土壤中的线虫。

根据实际应用，采集管的高度5～25cm。

本发明优选的，诱集孔为两个，两诱集孔之间的间距为0.5～2mm。

利用上述昆虫病原线虫种群密度检测装置检测昆虫病原线虫种群密度的方法，包括步骤如下：

(1)选择需要检测的地块，利用线虫种群密度检测装置进行检测；

(2)根据检测不同深度土壤中的线虫安装不同型号的采集管，将采集管和捕捉管拆离，然后将诱集物质装入网罩内，在捕捉管内装入清水至诱集孔处，然后将盛有清水的捕捉管与装有诱集物质网罩安装在一起；所述的诱集物质为韭蛆和韭菜根的组合，韭蛆与韭菜根的头数与根数比为：(5～25)：(3～6)，韭菜根的长度为0.5～2cm；

(3)在待检测的土壤上打一个洞，然后将步骤(2)中安装在一起的捕捉管、采集管整体放入洞中，间隔排布检测装置，保证诱集最大数量的线虫，其中采集管在上，捕捉管在下；

(4)放置40～50h后，从洞中取回检测装置，然后卸掉捕捉管，并将捕捉管中的水吸出后，在显微镜下观察水里线虫的个数；

(5)根据步骤(4)中观察到的线虫个数，计算获得土壤中线虫的种群密度。

根据本发明优选的，步骤(1)中待测土壤的湿度为10％-18％，气温在15～35℃。为了保证线虫在此环境条件下线虫在土壤中的扩散能力基本一致。湿度、温度过低或过高都会影响到线虫扩散能力，进而影响到诱集到线虫的数量。

本发明优选的，韭蛆与韭菜根的头数与根数比为：(15～25)：(4～6)，韭菜根的长度为1cm。

最为优选的，韭蛆与韭菜根的头数与根数比为：20：4。

本发明优选的，步骤(3)检测装置间隔排布的间距为10～14cm，每个处理重复4次进行诱集。

本发明优选的，步骤(4)检测装置在洞中放置时间为48h。

本发明优选的，所述韭蛆为3龄的活韭蛆。

本发明两层管状结构的采集管更好利用韭蛆+韭菜根的气味来诱集线虫，同时大大提高线虫的诱集效果，且阻碍了进入捕捉管内线虫逃离到土壤中。将网罩中的大蜡螟幼虫改进为韭蛆+韭菜根的组合，这一设计是根据线虫、韭蛆和韭菜根的互作关系，利用韭菜根受到韭蛆为害。

有益效果

1、本发明改进检测装置，获得一种昆虫病原线虫种群密度检测装置及其使用方法，该装置和方法采用双层管状设计装置，利用韭蛆+韭菜根释放挥发性物质和二氧化碳来诱集线虫，改进诱集孔为环绕网罩四周设计为2个长孔，改进采集管结构上无纺布条密封安装部位使其下端浸入清水中，使线虫更容易通过无纺布中水分进行清水，且防止进入清水后的线虫再次逃离到土壤中，在此基础上将采集管的高度可以设计为不同型号，满足采集不同深度土壤中的线虫，这些改进提高了诱集线虫效果，其绝对误差最小为0.429，是CN101849534A公开装置所检测数量的6.75倍，表现出最好的检测效果。

2、本发明装置和方法可以取代常规用大蜡螟活体诱集线虫的方法，解决了CN101849534A装置中诱集效果低的问题，提高线虫检测效果，可实现实时田间监测土壤中线虫在数量和存活情况，且田间取样不会破坏田间作物，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明昆虫病原线虫种群密度检测装置采集管的结构示意图；

图2为本发明昆虫病原线虫种群密度检测装置诱集网罩与捕捉管的结构示意图；

图3为本发明昆虫病原线虫种群密度检测装置整体结构示意图；

其中，1、采集管；2、捕捉管；3、密封塞；4、采集内管；5、采集外管；6、螺丝纹；7、诱集网罩；8、捕捉管侧壁；9、诱集孔；10、无纺布10；11、清水。

图4不同材料对昆虫病原线虫诱集效果的柱状图；

图5不同数量韭蛆+韭菜根组合对昆虫病原线虫诱集效果的柱状图；

图6不同取样时间对昆虫病原线虫诱集效果的曲线图；

图7检测器放置间距对对昆虫病原线虫诱集效果的曲线图；

图8韭蛆+韭菜根组合对昆虫病原线虫诱集趋势标准曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

一种昆虫病原线虫种群密度检测装置，结构如图1-图3所示，该装置包括两层管状结构的采集管1和捕捉管2，采集管1包括采集内管4和采集外管5两层，采集内管4和采集外管5两端均开口设置，采集内管4的底端螺纹连接有诱集网罩7，捕捉管2位于采集外管5的底端并与采集外管5螺纹连接，诱集网罩7位于采集外管5内，捕捉管2为上端开口、下端封闭的管状结构，环绕捕捉管2的侧壁上设有2个诱集孔9，两诱集孔之间的间距为1mm，诱集孔9的宽度为10mm，在捕捉管2内填充有清水11，在捕捉管2的内壁上设置有密封诱集孔的无纺布，并且无纺布10的下端延伸至清水11中。

采集内管4与采集外管5之间的间距为4mm，采集管1的顶端设置有密封塞3，将采集管密封并将采集内管和采集外管连接在一起。

诱集网罩7的高度为18mm，诱集网罩7的内径与采集内管4相匹配。捕捉管2的高度为40mm，捕捉管2的内径与采集外管5相匹配。

诱集网罩7的底端距离诱集孔9下端2mm。该距离既保证了最佳的诱集效果，又有效的防止诱集的线虫逃离。无纺布的下端延伸至清水的长度为5mm。延伸的长度可以使线虫更容易通过无纺布中水分进行清水中，且进入清水后线虫再难于逃离到土壤中。采集管1的高度5～60cm。采集管的高度满足采集不同深度土壤中的线虫。

实施例2

同实施例1所述一种昆虫病原线虫种群密度检测装置，不同之处在于，

采集内管4与采集外管5之间的间距为6mm。

实施例3

同实施例1所述一种昆虫病原线虫种群密度检测装置，不同之处在于，

采集内管4与采集外管5之间的间距为2mm。

实施例4

同实施例1所述一种昆虫病原线虫种群密度检测装置，不同之处在于，

诱集网罩7的底端距离诱集孔9下端1mm。

实施例5

同实施例1所述一种昆虫病原线虫种群密度检测装置，不同之处在于，

诱集网罩7的底端距离诱集孔9下端4mm。

室内试验测定

1、不同材料对昆虫病原线虫诱集效果的比较

选用小卷蛾斯氏线虫Steinernema carpocapsae All泰安市绿农生物科技有限公司有售。

将5kg灭菌土装入圆形塑料盆中，加入无菌水和线虫悬浮液，使土壤湿度保持在10％左右。侵染期幼虫(IJS)按45万IJS/m²接种线虫，将昆虫病原线虫种群检测器垂直插入塑料盒中。试验在网罩中分别加入2头大蜡螟、20头韭蛆、机械损伤后的韭菜根、20头韭蛆+4根1cm韭菜根以及空白对照。接种线虫后48h调查种群检测器内诱集到的线虫数量。收集到检测器中的线虫悬浮液在显微镜下计数，每个处理重复4次，检测装置间距为10cm。

试验结果(图4)表明：5个处理对昆虫病原线虫诱集效果差异显著，其中在网罩中加入韭蛆+韭菜根组合诱集的线虫数量显著高于其它处理，是大蜡螟诱集数量的3.5倍以上，表明韭蛆+韭菜根组合更有利于线虫的诱集。

2、不同数量韭蛆+韭菜根组合对昆虫病原线虫诱集效果的比较；

试验在网罩中加入韭蛆的数量分别为5、10、20、40、80头，在分别加入一定数量的韭菜根，其它试验要求同试验1。

试验结果(图5)表明：5个处理对昆虫病原线虫诱集效果不同，其中在网罩中分别加入20头、40头和80头韭蛆+4根1cm韭菜根组合诱集的线虫数量显著高于加入5头和10头韭蛆的处理，且加入20头、40头和80头韭蛆+韭菜根组合间差异不显著。因此采用20头韭蛆+韭菜根组合进一步试验。

3、不同取样时间对昆虫病原线虫诱集效果的影响

试验在网罩中加入20头韭蛆+4根1cm韭菜根，分别在接种线虫后12、24、36、48、60、72、84和96h调查种群检测器内诱集到的线虫数量，其它试验要求同试验1。

试验结果(图6)表明：不同取样时间对昆虫病原线虫诱集效果不同，且随着时间的延长诱集的线虫数量。从48h～96h取样时，诱集的线虫数量显著高于12、24和36h。表明采用此检测器最佳取样时间为48h。

4、检测器放置间距对昆虫病原线虫诱集效果的影响

试验在网罩中加入20头韭蛆+4根1cm韭菜根，检测装置间隔排布的间距分别为2、6、10、14、18和22cm，在接种48h后调查种群检测器内诱集到的线虫数量，其它试验要求同试验1。

试验结果(图7)表明：检测器放置间距对昆虫病原线虫诱集效果差异显著，其中放置间距10～14cm时，诱集线虫数量显著高于其他放置间距。在放置2～6cm时，由于检测器之间距离较近，容易造成不同检测器间竞争；而放置距离在18～22cm时，由于检测器之间距离较远，形成每个检测器单打独斗的情况，诱集数量也较低。在放置间距10～14cm时，各检测器间可以形成良好的合作关系，发挥了韭蛆+韭菜根组合释放挥发性物质和二氧化碳的能力，提高了对线虫的诱集效果。

5、韭蛆+韭菜根组合对昆虫病原线虫诱集趋势标准曲线的建立

在已优化条件下，选择6个不同施用密度，其中包括田间最大应用密度和较小应用密度，检测进入检测器中的线虫数量，建立标准曲线。在土壤中分别加入5万、15万、25万、35万、45万和55万/m²(分别相当于0.34亿、1亿、1.6亿、2.3亿、3亿、3.7/亩)的线虫悬浮液，利用本发明装置进行回收，然后根据实际浓度梯度和回收线虫数量通过线性回归制定出标准曲线。如图8所示，对应的线性方程为y＝5.138x+0.881，其中x为横坐标，为土壤中混入的每平方米的线虫数，y为纵坐标，为检测到的线虫数。相关系数R²＝0.9976，表明此装置诱集效果稳定，可以满足田间线虫种群密度的检测。

田间试验

试验在山东省果树所万吉山试验基地，土质为疏松和通气性好的砂壤土。

实施例6

利用实施例1的昆虫病原线虫种群密度检测装置进行分离与检测的方法，方法如下：

(1)选择需要检测的种植韭菜地块，在韭菜地施用线虫浓度5万/m²，土壤湿度12％，气温在22℃，利用线虫种群密度检测装置进行检测；

(2)根据检测不同深度土壤中的线虫安装不同型号的采集管，将采集管和捕捉管拆离，然后将诱集物质装入网罩内，在捕捉管内装入清水至诱集孔处，然后将盛有清水的捕捉管与装有诱集物质网罩安装在一起；所述的诱集物质为韭蛆和韭菜根的组合，韭菜根的长度为1cm；韭蛆为3龄活韭蛆，20头，韭菜根为1cm的韭菜根，4根。

(3)在待检测的土壤上打一个洞，然后将步骤(2)中安装在一起的捕捉管、采集管整体放入洞中，间隔10cm排布检测装置，保证诱集最大数量的线虫，其中采集管在上，捕捉管在下；

(4)放置48后，从洞中取回检测装置，然后卸掉捕捉管，并将捕捉管中的水吸出后，在显微镜下观察水里线虫的个数；

(5)根据步骤(4)中观察到的线虫个数，计算获得土壤中线虫的种群密度。

实施例7

同实施例1的分离与检测方法，其他条件同实施例1，不同之处在于，检测用的诱集物质为5头韭蛆+4根1cm韭菜根。

实施例8

同实施例1的分离与检测方法，其他条件同实施例1，不同之处在于，放置检测器间距为20cm。

实施例9

同实施例1的分离与检测方法，其他条件同实施例1，不同之处在于，放置时间为24h。

对比例1

同实施例1的分离与检测方法，其他条件同实施例1，不同之处在于，该方法采用CN101849534A公开的一种昆虫病原线虫分离与检测装置中的装置进行。

对比例2

同实施例1的分离与检测方法，其他条件同实施例1，不同之处在于，该方法采用CN101849534A公开的一种昆虫病原线虫分离与检测装置中的装置进行，检测用的诱集物质为大蜡螟。

对比例3

同实施例1的分离与检测方法，该方法采用本发明的装置进行，其他条件同实施例1，不同之处在于，检测用的诱集物质为大蜡螟。

试验例

田间试验共设7个处理，分别使用本发明装置检测和CN101849534A公开装置检测(实施例1组、实施例2组、实施例3组、实施例4组、对比例1组、对比例2组和对比例3组)。步骤分别采用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4和对比例1组、对比例2组、对比例3组所述的方法，小区面积20m²，重复3次，每个处理重复4次，随机取样。具体条件步骤见表1。

表1试验处理的方法

表2不同检测装置田间检测结果对比

由表2可以看出，采用本发明装置进行检测的实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、和对比例3检测到田间线虫数量显著高于CN101849534A公开装置对比例1和对比例2。采用本发明所采用的20头韭蛆+韭菜根组合物诱集检测的实施例1、实施例3、实施例4和对比例1所获得的线虫数量显著高于采用大蜡螟作为诱集物的对比例2和对比例3。采用本发明实施例1所获得的线虫数量显著高于实施例2组、实施例3组、实施例4组、对比例1组、对比例2组和对比例3组，其绝对误差最小为0.429，是CN101849534A公开装置所检测数量的6.75倍，表现出最好的检测效果。