本发明涉及红栌种植的技术领域，具体而言，涉及一种美国红栌外植体的消毒方法。
背景技术：
美国红栌为美国黄栌的变种类型，漆树科，黄栌属植物。为落叶灌木或小乔木，原产美国。引入中国后，经优选和驯化，现已表现出独特的彩叶树性状。其树形美观大方，叶片大而鲜艳，植株通过园艺措施可具有乔木性状。
现有技术中，外植体的消毒通常使用例如次氯酸或双氧水等作为消毒试剂。虽然这些消毒试剂对外植体表面和组织内的细菌、真菌、病毒等具有一定的消毒作用，但对外植体的伤害较大，往往造成外植体萌芽慢、弱或芽死亡。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明在于提供一种美国红栌外植体的消毒方法，该消毒方法具有较好的消毒效果，对外植体具有较小的伤害。
一种美国红栌外植体的消毒方法，包括以下步骤：
(1)将美国红栌的外植体以表面活性剂液进行浸渍；
(2)将经步骤(1)的外植体以酒精进行浸渍；
(3)将经步骤(2)的外植体以升汞溶液进行浸渍。
进一步地，所述表面活性剂溶液为阴离子表面活性剂和高分子表面活性剂。
进一步地，所述以表面活性剂液进行浸渍的时间为10～20min。
进一步地，所述以酒精进行浸渍的时间为1～5min。
进一步地，所述酒精的体积浓度为60～80vol％。
进一步地，所述以升汞溶液进行浸渍的时间为10～20s。
进一步地，所述升汞溶液的质量分数为0.05～015wt％。
进一步地，所述步骤(1)之后、在步骤(2)之前还包括使用清水冲洗20～40min。
进一步地，所述步骤(2)之后、在步骤(3)之前还包括使用无菌水冲洗4～6次。
进一步地，所述步骤(3)之后还包括使用无菌水冲洗6～8次。
本发明的美国红栌外植体的消毒方法，先使用表面活性剂液浸渍，这样去除植物油脂等有机污渍，再使用酒精进行浸渍，这样以去除杀死外植体表面的细菌、真菌的营养体；最后，使用升汞快速杀死细菌芽孢和真菌孢子，由此达到了较好的消毒效果，对外植体具有较小的伤害。
具体实施方式
除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量分数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)；
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
本发明的美国红栌外植体的消毒方法，包括以下步骤：
(1)将美国红栌的外植体以表面活性剂液进行浸渍；
(2)将经步骤(1)的外植体以酒精溶液进行浸渍；
(3)将经步骤(2)的外植体以升汞溶液进行浸渍
上述步骤(1)中，以表面活性剂液进行浸渍，主要可以去除外植体内的植物油脂和附着于外植体表面的油脂等有机污渍。
此处，表面活性剂是指是指加入少量能使其溶液体系的界面状态发生明显变化的物质，具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列的物质。作为本发明的表面活性剂可优选为阴离子表面活性剂和高分子表面活性剂。阴离子表面活性剂，是指阴离子中带有亲水基团和亲油基团的表面活性剂。阴离子表面活性剂即可以为脂肪酸盐，如硬脂酸钠、硬脂酸钙、硬脂酸镁等；或者可为硫酸盐，如十二烷基硫酸钠、十六醇硫酸钠等；或者可为磺酸盐，如十二烷基苯磺酸钠、二己基琥珀酸磺酸钠、二辛基磺化琥珀酸钠等；或者可为胆盐，如甘胆酸钠、牛胆磺酸钠等。本发明的阴离子表面活性剂可优选为十二烷基硫酸钠。高分子型表面活性剂，是指那些分子量在数千(5000)以上，并具有表面活性功能的高分子化合物。本发明所述高分子型表面活性剂可以为阴离子型，如以羧甲基纤维素、羧甲基丙烯酸钠、羧基改性聚丙烯酰胺、聚丙烯酸钠为代表的羧酸盐型，以缩合萘磺酸、聚苯乙烯磺酸盐、木质素磺酸盐为代表的磺酸盐类，以缩合烷基苯醚硫酸酯为代表的硫酸酯类，硫酸酯类等；或者可以为阳离子型，如以氨基烷基丙烯酸酯共聚物、改性聚乙烯为代表的胺类，以聚1-十二烷基-4-乙烯吡啶溴化物[聚皂(Polysoap)]、聚-4-乙烯溴化十二烷基吡啶、聚乙烯苯甲基三甲铵盐为代表的季铵盐类；或者可以是两性离子，如氨基酸类聚合物；或者可以为非离子型，如甜菜碱类，以羟乙基纤维素、聚乙烯醇为代表的多元醇，聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇醚、聚氧乙烯缩合烷基苯醚等其它。优选为聚丙烯酸钠。
上述表面活性剂液的浓度不作特别限定，可参考性地，其质量分数可以为1～10wt％。
本发明中，以表面活性剂液进行浸渍的时间以10～20min为佳，如可以为10min、11min、12min、15min、18min、19min、20min。至于浸渍的温度可在常温下进行。
在步骤(1)之前，为了去除外植体表面的灰尘或粉尘等，可以使用刷去其表面的灰尘。
步骤(2)中，以酒精溶液进行浸渍的作用是杀死外植体表面的细菌、真菌的营养体。因为组培试验主要采用的美国红栌的外植体是当年生的幼嫩茎段、顶芽、幼嫩叶片等，而细菌、真菌大部分是附着在材料表面的，可彻底杀死外植体表面的微生物。
酒精溶液，可以理解的是，指酒精的水溶液。其体积浓度较好地为60～80vol％，如60vol％、62vol％、65vol％、70vol％、75vol％、78vol％或80vol％等。
以酒精溶液进行浸渍的时间较好地可以是1～5min，如1min、1.5min、2min、3min、4min、4.5min或5min。至于浸渍的温度可在常温下进行。
步骤(3)中，以升汞溶液进行浸渍的目的是，杀死细菌的芽孢或真菌的孢子(相当于植物的种子)，细菌的芽孢和真菌的孢子一遇到合适的条件(温度、湿度等)就能再次萌发感染。
上述升汞溶液的质量分数可参考性地为0.05～015wt％，例如0.05wt％、0.055wt％、0.06wt％、0.08wt％、0.1wt％、0.12wt％、0.14wt％或0.15wt％等。
以升汞溶液进行浸渍的时间可较好地为10～20s，如10s、12s、15s、18s、20s等。至于浸渍的温度可在常温下进行。
上述步骤(1)之后、在步骤(2)之前还可以包括使用清水冲洗20～40min，如20min、22min、25min、30min、35min、38min或40min等。清水清洗的目的是，为了去除残留的表面活性剂液。
上述步骤(2)之后、在步骤(3)之前还包括使用无菌水冲洗4～6次，如4次、5次、6次等。无菌水冲洗的目的是为了去除已杀死的细菌、真菌营养体和酒精溶液残留液，以降低对升汞溶液浸渍的影响效果。此处，无菌水是指通过高温蒸汽法,UHT热法,化学法,臭氧方法和物理过滤法将水中微生物杀死或过滤掉而得到的水。
在步骤(3)之后还可以包括使用无菌水冲洗6～8次，如6次、7次、8次等。无菌水冲洗的目的是去除细菌芽孢、真菌孢子和升汞残留液。
以上未述及之处适用于现有技术。
实施例1
步骤一、处理外植体表面的污垢。刷去外植体材质表面的灰尘，再置入表面活性剂液中浸渍。
步骤二、使用自来水冲洗20～40min。
步骤三、使用体积浓度为70vol％的酒精溶液进行浸渍3min。
步骤四、使用无菌水冲洗5次。
步骤五、使用质量分数为0.1wt％的升汞溶液进行浸渍10s。
步骤六、使用无菌水冲洗7次。
实施例2
步骤一、处理外植体表面的污垢。刷去外植体材质表面的灰尘，再置入表面活性剂液中浸渍。
步骤二、使用自来水冲洗20～40min。
步骤三、使用体积浓度为70vol％的酒精溶液进行浸渍3min。
步骤四、使用无菌水冲洗5次。
步骤五、使用质量分数为0.1wt％的升汞溶液进行浸渍15s。
步骤六、使用无菌水冲洗7次。
实施例3
步骤一、处理外植体表面的污垢。刷去外植体材质表面的灰尘，再置入表面活性剂液中浸渍。
步骤二、使用自来水冲洗20～40min。
步骤三、使用体积浓度为70vol％的酒精溶液进行浸渍3min。
步骤四、使用无菌水冲洗5次。
步骤五、使用质量分数为0.1wt％的升汞溶液进行浸渍20s。
步骤六、使用无菌水冲洗7次。
实施例4
步骤一、处理外植体表面的污垢。刷去外植体材质表面的灰尘，再置入表面活性剂液中浸渍。
步骤二、使用自来水冲洗30min。
步骤三、使用体积浓度为60vol％的酒精溶液进行浸渍5min。
步骤四、使用无菌水冲洗4次。
步骤五、使用质量分数为0.05wt％的升汞溶液进行浸渍20s。
步骤六、使用无菌水冲洗6次。
实施例5
步骤一、处理外植体表面的污垢。刷去外植体材质表面的灰尘，再置入表面活性剂液中浸渍。
步骤二、使用自来水冲洗20min。
步骤三、使用体积浓度为60vol％的酒精溶液进行浸渍5min。
步骤四、使用无菌水冲洗4次。
步骤五、使用质量分数为0.15wt％的升汞溶液进行浸渍15s。
步骤六、使用无菌水冲洗8次。
实施例6
步骤一、处理外植体表面的污垢。刷去外植体材质表面的灰尘，再置入表面活性剂液中浸渍。
步骤二、使用自来水冲洗40min。
步骤三、使用体积浓度为80vol％的酒精溶液进行浸渍1min。
步骤四、使用无菌水冲洗6次。
步骤五、使用质量分数为0.05wt％的升汞溶液进行浸渍15s。
步骤六、使用无菌水冲洗6次。
实施例1～3的消毒方法的评价如下：
取美国红栌的茎段(约2～3cm)10个，按照以上实施例的方法进行消毒，再按照每瓶1个茎段分别接种到装有0.5浓度的MS营养液的培养瓶中，统计第一天到第十五天，观察每一天培养瓶内是否出现污染、褐化、萌芽的现象，并记录其中长势最为良好的一个营养瓶中茎段所长出的新梢高度，结果如下表1～表3：
表1实施例1的评价结果
表2实施例2的评价结果
表3实施例3的评价结果
从以上实施例可以看出，本发明的消毒方法较好的消毒效果，对外植体具有较小的伤害。
由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现，但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本发明，当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处，出于篇幅的考虑，省略了给出某一项或多项数值范围内具体值的实施例，此不应当视为本发明的技术方案的公开不充分。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式选择等，落在本发明的保护范围内。