本发明属于植物组织培养技术的再生领域，具体涉及到一种马铃薯茎尖培养基、制备方法及其应用。
背景技术：
由于环境的污染或是病毒代代的累积，现在的植物中已经沉积了大量的病毒，导致植物病变影响产品的质量与数量；若是食用性植物，将严重影响人们的健康，其中，属于无性繁殖的植物，在生长过程中极易受到病毒的感染，例如，侵染马铃薯病毒多达30多种，而且随着时间的推移，植物一代一代的遗传，侵染马铃薯病毒种类会越来越多，现在马铃薯病毒已经成为全球普遍性的问题，严重影响农业的发展。
目前，人们通用的化学类药剂仅仅对细菌或真菌导致的病害有效，但是对病毒浸染的植物作用极小，因此，培养无病毒植物苗具有重要的现实意义和应用价值。常用的防治病毒方法为物理法，即通过X射线、紫外线和高温等进行处理，达到钝化病毒的目的，但是，物理法在防治病毒中属于小概率杀毒，而且同时也对植株造成了伤害，例如：基因突变或是组织受损等。还有化学法杀毒，使用抑制病毒复制的药物进行杀毒，但是同时会对寄主组织造成了伤害，推广性差。工业中常用的方法为生物学方法，即对种子、愈伤组织或是茎尖进行培养，但是种子培养只针对有性繁殖有效，愈伤组织培养易变异，因此，常用的手段为茎尖脱毒培养，而且周期短、成活率高等优点。
茎尖培养的脱毒原理是由于茎尖是新生长组织，或是激素含量的不同，导致病毒感染的几率小，含量低，因此，茎尖培养已经成为解决马铃薯病毒的主要途径，但是，茎尖培养技术需要进一步改进。
公开号为105532479A的中国专利公开了一种马铃薯茎尖分化培养基及制备方法。所述培养基的配方中含有L-半胱胺酸盐酸盐，以1L培养基计算，所述L-半胱胺酸盐酸盐的含量为0.1mg。所述配方为①或②，①：MS培养基+吲哚乙酸0.1mg/L+6-苄基嘌呤0.1mg/L+赤霉酸0.1mg/L+L-半胱胺酸盐酸盐0.1mg/L+30g/L蔗糖+5-7g/L琼脂粉；②：MS培养基+NAA 0.1mg/L+6-苄基嘌呤0.1mg/L+赤霉酸0.1mg/L+L-半胱胺酸盐酸盐0.1mg/L+30g/L蔗糖+5-7g/L琼脂粉。该发明在马铃薯组培用培养基(MS培养基)中添加L-半胱氨酸盐酸盐，作为抗氧剂，减少褐化现象，以增加马铃薯茎尖分生组织的成苗率。但是在茎尖培养过程中使用1个浓度的MS培养基铵态氮含量过高，而且还加入了其他营养物质，会使茎尖培养中生长速度慢，而且L-半胱氨酸盐酸盐在光照条件下易分解，破坏培养基的电解质平衡，不仅如此，分解产生的物质不确定，可能会影响植物的发育。
技术实现要素：
为了进一步改进现有技术，促进茎尖培养的生长速度与出苗率，本发明公开了一种马铃薯茎尖培养基及其应用。本发明是对MS培养基的进一步改良，使之更适应马铃薯茎尖的培养。
本发明技术方案如下所示：
一种马铃薯茎尖培养基，所述的培养基配方为：0.8MS培养基、150-250mg/L KNO3、40-100mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.1-0.3mg/L龙葵碱、0.2-0.4mg/L吲哚乙酸、0.2-0.5mg/L 6-苄基嘌呤、0.05-0.2mg/L赤霉酸、0.5-1mg/L谷胱甘肽、25-35g/L蔗糖和8-10g/L琼脂。。
进一步的，所述的培养基配方为：0.8MS培养基、210mg/L KNO3、65mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.15mg/L龙葵碱、0.3mg/L吲哚乙酸、0.3mg/L 6-苄基嘌呤、0.12mg/L赤霉酸、0.7mg/L谷胱甘肽、32g/L蔗糖和9g/L琼脂。
其中MS培养基的配比为：大量元素为：NH4NO31650，KNO31900，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O 370，KH2PO4170微量元素：KI 0.83，H3BO36.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MoO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，铁盐：FeSO4·7H2O(27.8)，Na2-EDTA·2H2O(37.3)，有机物质：肌醇100，烟酸0.5，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5，盐酸硫胺素(维生素B1)0.1，甘氨酸2.0，单位为mg/L。
进一步的，本发明提供了所述的马铃薯茎尖培养基的制备方法，步骤为
S1：将MS培养基稀释至浓度为原来的0.8倍，然后加入KNO3、Ca(H2PO4)2·H2O、龙葵碱、吲哚乙酸、6-苄基嘌呤、赤霉酸、谷胱甘肽，搅拌均匀，得液体A；
S2：取1/3步骤S1制得的液体A倒人小铝锅中煮沸，再将蔗糖、琼脂倾人小铝锅中，边加热边搅拌，直至琼脂全部融化即清澈见底为止，然后倒入余下的液体A，搅拌均匀，得胶状物B；
S3：使用1M的NaOH或HCl溶液调节步骤S2得到的胶状物B的pH值至5.8，115-125℃蒸汽灭菌，灭菌15-25分钟，降至室温，即得。
进一步的，步骤S1和S2中的搅拌速度为45-60r/min。
进一步的，所述的马铃薯茎尖培养基在马铃薯茎尖诱导组织培养中的应用。
培养方法为：在无菌环境下，从消毒后的马铃薯茎尖上剥去生长在锥外围的幼叶和叶原基，直至露出圆滑的生长锥。切取0.2-0.4mm带有1-2片叶原基的生长锥，接种在所述的培养基上，置于22-25℃，光照强度2200-2800LX，12-16h/d的光照条件下培养。
磷酸二氢钙：被称为重过磷酸钙，为灰白色粉末，含有效P4O10高达30％～45％，为普通过磷酸钙的两倍以上。重过磷酸钙主要用作酸性磷肥。将磷酸二氢钙应用到供给植物磷、钙等元素，可用作基肥、根外追肥、叶面喷洒。与氮肥混合使用，有固氮作用，减少氮的损失。能促进植物的发芽、长根、分枝、结实及成熟，可用作生产复混肥的原料。本发明将Ca(H2PO4)2·H2O应用到培养基中，发现添加适量浓度的Ca(H2PO4)2·H2O，可以促进茎尖的发育，提高生长速度。
龙葵碱：广泛存在于马铃薯、番茄及茄子等茄科植物中。在番茄青绿色未成熟时，里面含有龙葵碱。马铃薯发芽后，其幼芽和芽眼部分的龙葵碱含量高达0.3％～0.5％。
谷胱甘肽：是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合，含有巯基的的三肽，具有抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽参与生物转化作用，其中植物生长会使机体代谢产生的过多自由基会损伤生物膜，加快机体衰老，尤其是培养基中植物，抵抗力弱，加入谷胱甘肽可以提高马铃薯的成活率。
本发明是在MS培养基的基础上将其稀释，然后添加了KNO3、Ca(H2PO4)2·H2O、龙葵碱、吲哚乙酸、6-苄基嘌呤、赤霉酸、谷胱甘肽、蔗糖和琼脂。其中稀释MS基础培养基的目的是减少氮源中氨盐的含量，减少铵态氮的含量，有利于培养物的生长，成苗率高；加入的KNO3一方面是为了补充硝态氮元素，另一方面是为了补充钾元素，适当的提高钾元素的含量，有利于发芽率；加入的Ca(H2PO4)2·H2O与氮源混合使用，有固氮作用，减少氮的损失，而且促进植物的生长；本发明还加入了少量的龙葵碱，广泛存在于马铃薯的幼芽中，试验证明加入少量的龙葵碱可以促进马铃薯的出苗率；添加的谷胱甘肽有利于提高植物的抵抗力，保持植物旺盛生命力，并且减少愈伤组织的褐化。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1、本发明提供的马铃薯茎尖培养基是在MS基础培养基的改良，丰富了培养基的营养物质，提高了马铃薯的质量。
2、本发明提供的培养基对马铃薯的脱毒具有良好的效果，进一步的改进了马铃薯苗的品质。
3、本发明培养基促进了马铃薯的生长速度，减少了育苗周期，降低了成本，有利于提高脱毒效率。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步说明，但并非是对本发明的限制。本发明培养基购自北京拜尔迪生物技术有限公司供应的Sigma的MS培养基。
实施例1
一种马铃薯茎尖培养基，所述的培养基配方为：0.8MS培养基、210mg/L KNO3、65mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.15mg/L龙葵碱、0.3mg/L吲哚乙酸、0.3mg/L 6-苄基嘌呤、0.12mg/L赤霉酸、0.7mg/L谷胱甘肽、32g/L蔗糖和9g/L琼脂。
所述培养基的制备方法为，步骤为：
S1：将MS培养基稀释至浓度为原来的0.8倍，然后加入KNO3、Ca(H2PO4)2·H2O、龙葵碱、吲哚乙酸、6-苄基嘌呤、赤霉酸、谷胱甘肽，搅拌均匀，搅拌速度为50r/min，得液体A；
S2：取1/3步骤S1制得的液体A倒人小铝锅中煮沸，再将蔗糖、琼脂倾人小铝锅中，边加热边搅拌，搅拌速度为50r/min，直至琼脂全部融化即清澈见底为止，然后倒入余下的液体A，搅拌均匀，得胶状物B；
S3：使用1M的NaOH或HCl溶液调节步骤S2得到的胶状物B的pH值至5.8，120℃蒸汽灭菌，灭菌20分钟，降至室温，即得。
实施例2
一种马铃薯茎尖培养基，所述的培养基配方为：0.8MS培养基、150mg/L KNO3、40mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.3mg/L龙葵碱、0.2mg/L吲哚乙酸、0.5mg/L 6-苄基嘌呤、0.05mg/L赤霉酸、1mg/L谷胱甘肽、25g/L蔗糖和10g/L琼脂。
所述培养基的制备方法与实施例1类似。
实施例3
一种马铃薯茎尖培养基，所述的培养基配方为：0.8MS培养基、250mg/L KNO3、100mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.1mg/L龙葵碱、0.4mg/L吲哚乙酸、0.2mg/L 6-苄基嘌呤、0.2mg/L赤霉酸、0.5mg/L谷胱甘肽、35g/L蔗糖和8g/L琼脂。
所述培养基的制备方法与实施例1类似。
对比例1
一种马铃薯茎尖培养基，所述的培养基配方为：0.8MS培养基、210mg/L KNO3、65mg/L Ca(H2PO4)2·H2O、0.15mg/L龙葵碱、0.3mg/L吲哚乙酸、0.3mg/L 6-苄基嘌呤、0.12mg/L赤霉酸、0.85mg/L L-半胱胺酸盐酸盐、32g/L蔗糖和9g/L琼脂。
与实施例1相比，区别是将谷胱甘肽替换为L-半胱胺酸盐酸盐。
所述培养基的制备方法与实施例1类似。
试验例1
培养基：实施例1-3、对比例1制得的马铃薯茎尖培养基。
在无菌环境下，从消毒后的马铃薯(中薯5号)茎尖上剥去生长在锥外围的幼叶和叶原基，直至露出圆滑的生长锥。切取0.3mm带有2片叶原基的生长锥，接种在所述的培养基上，置于24℃，光照强度2500LX，14h/d的光照条件下培养，3天换一次培养基，每个试验处理3次重复，每个重复50个茎尖，培养50天观察成苗率和芽的生长表现，具体结果如表1所示。
表1茎尖生长状况
从表1中可以看出，本发明实施例1-3培养基培养的出苗率达到了93％以上，成苗时间28.5-32天，移栽成活率在91％以上，幼苗叶片深绿、茎部健壮、无黄化现象，移栽后植株健壮、根系质量好，说明经过改良后的MS培养基有利于马铃薯的茎尖培养，而与对比例1相比，将谷胱甘肽替换为L-半胱胺酸盐酸盐，成苗时间稍短，而且移栽成活率略低于本发明，植株质量也稍差，原因可能是L-半胱胺酸盐酸盐的光不稳定。
综上所述，本发明丰富了培养基的营养物质，提高了马铃薯植株的质量，促进了马铃薯的生长速度，减少了育苗周期，降低了成本，有利于提高脱毒效率。
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。