一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法与流程

本发明涉及鱼类遗传育种领域，具体是一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法。

背景技术：

翘嘴鳜鱼(Siniperca chuatsi)隶属于鲈形目(Perciformes)鳍科(Serranidae)鳜亚科(Sinipercinae)鳜属(Siniperca)，为我国淡水名贵鱼类，其肉质洁白细嫩、肥厚鲜美、无小刺、富含人体所需的8种氨基酸，具有极高的营养价值和食疗作用。鳜终生以其它鱼类活饵为食，在鳜属鱼类中的几种鳜鱼(例如大眼鳜、斑鳜、翘嘴鳜)中，翘嘴鳜的体型最大、生长速度最快，因此翘嘴鳜是我国鳜养殖业中最主要的种类。在本项目的以下陈述中，除非特别说明，本申请项目中所说的研究对象“鳜”均是指“翘嘴鳜”(Siniperca chuatsi)。

自从上世纪80年代鳜鱼人工繁育取得成功以来，鳜鱼养殖业呈逐渐上升的趋势，养殖30多年来经久不衰，目前全国鳜鱼产业规模年产值已达500亿元以上，在淡水名优鱼类中占有非常独特的地位。水产养殖业与农业一样，优良的品种对于养殖产量的高低起着非常重要的作用。作为我国的一个重要的淡水名优经济鱼类，鳜人工繁殖技术的解决及完善为大规模养殖创造了条件。通过对鳜进行驯化、试养和人工繁殖，目前已经建立了一套完整的生产养殖技术。但是全国目前所养殖的鳜极度缺乏优良品种，繁殖亲本主要来自长江等水系捕捞的野生鳜或经过数代人工养殖的鳜，野生种质资源却越来越难得获取；另外随着鳜养殖业的发展，养殖规模扩大，养殖密度也是不断提高，水域生态坏境不断的遭到人为的破坏，导致鳜疾病呈爆发之势，养殖过程中所面临的问题如杂合度下降、遗传多样性降低、生长慢、抗病差等问题也日益严重。此外子代生长速度较慢、抗病力弱、驯食能力差、种质资源退化、适应集约化养殖能力较弱等问题严重制约了鳜养殖养殖业的发展，使得湖北水产界做大做强鳜产业的愿望进展较慢。与世界发达国家相比，我国的水产养殖业在技术水平发展上还处于一个较低的阶段，尤其是在当今全球化的背景下仍然面临着非常多的科技问题的困扰，其中经过遗传改良具有“高产、优质”性状的优良品种的缺失则是重大问题之一。因此，为保证水产养殖业的持续健康稳定的发展，需要将现代先进育种技术理论应用到实践当 中去，大力开展和开发名贵经济水产品的人工繁育和养殖。国内外的水产养殖经验已证实，在同等条件下使用优良品种比使用普通品种的增产效果可达10％-30％甚至更高。因此开展遗传育种研究，培育生长速度快、抗病力强等经济性状好的鳜优良品种(系)对于保护鳜自然资源和满足当前养殖业的迫切需要具有极其重要的现实意义。

传统水产动物良种选育过程，采用不断近交的方式构建纯系至少需要经过连续2O代的全同胞交配，这对于鱼类育种来说，具有耗时长、成本高等问题。

人工雌核发育是一种较为特殊的有性生殖方式，即卵子经遗传物质失活的精子激发产生只具有母系遗传物质的个体的有性生殖方式，经此技术诱导的个体是可以存活并且可育的，其遗传物质与母本完全相同；且卵核的遗传成分决定雌核发育个体的性别，如亲本是雌性同配(即类似于XX/XY型性别决定，大部分鱼类都属于此类)，那么由其雌核发育而来的后代全部都是雌性。人工雌核发育技术在水产动物育种工作中相比其他育种方法具有十分明显的特点：它可进行性别控制，其后代全为单性；还可以快速的建立纯系，加速良种选育的过程，提高良种选育效率。20世纪70年代，我国开始进行人工雌核发育技术研究，且已经成功应用于鲤(Cyprinus carpio)、虹鳟(Salmo gairdneri)等近30种经济鱼类。这些通过人工雌核发育技术进行提纯复壮，获得具有优良养殖性能的新品种或选育出全雌单性苗种，进而对品种进行优化，在鱼类育种中具有重要意义，是鱼类遗传改良的主要发展方向之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法，其主要步骤如下：

S1：冷冻保存斑鳜异源精子：采用Hanks冷冻稀释液对斑鳜精子进行冷冻低温(-24℃)保存，保存期为24h。解冻时，将冷冻精液管在25℃水浴中解冻备用；

S2：班鳜精子的遗传失活：解冻后的斑鳜精液，按1：4的比例经Hanks冷冻液稀释后放入一个直径10cm的培养皿中，在冰盒上手动摇匀后连同冰盒一起 放置在水平摇床上，然后用两根15W UV紫外照射管充分照射25分钟，照射距离17cm；照射后，将灭活的精液虹吸至一个5mL的Ep管中，放入冰盒中保存；

S3：获得翘嘴鳜的卵子：2龄以上的性成熟雌鱼通过注射外源催产激素发情后，采用干法将卵子挤入干燥的器皿中，放入冰盒中保存；

S4：启动卵子雌核发育：将S2得到的遗传失活的翘嘴鳜精子与S3得到的翘嘴鳜成熟卵子摇匀混合受精，受精时间30s；

S5：卵子单倍体染色体组加倍：受精后，转移到淡水中进行冷休克处理，水温4℃，时间约20～25min，得到二倍体卵；

S6：将S5所得到的二倍体卵转入方形孵化槽中孵化，水温25℃，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理，得到翘嘴鳜雌核发育二倍体鱼苗，二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为10～25％；

S7：用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗。

作为本发明进一步的方案：所述S1中Hanks冷冻稀释液由以下原料配制而成：KCL 0.4g,NaCL 8.00g，NaHCO3 0.35g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·7H2O0.09g,Na2HPO4·12H2O 0.10g,MgSO4·7H2O 0.10g,MgCL2·6H2O 0.10g,CaCL2 0.14g,Glucose 1.00g；加蒸馏水配至1升。

作为本发明再进一步的方案：所述S2中紫外照射管照射强度为3396μW(cm3·s)。

作为本发明再进一步的方案：所述S3中外源催产激素由以下原料在23℃～27℃的温度条件下混合而成：促黄体素释放激素类似物(LRH-A2)4μg/Kg～6μg/Kg和绒毛膜促性腺激素(HCG)800IU/Kg～1200IU/Kg。

作为本发明再进一步的方案：所述S5中冷休克处理起始时间是在卵子受精后2-3min。

作为本发明再进一步的方案：所述S5中冷休克处理时间为25min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明通过一套完整的异源精子诱导方法产生翘嘴鳜雌核发育苗种，经过养殖过程逐步淘汰雌核发育后代中的劣势个体，得到了全部为雌性的优势翘嘴鳜群体。一代翘嘴鳜雌核发育的近交效果大致相当于6-7代的全同胞家系的近交效果，这为建立翘嘴鳜纯系，快速优化和固定翘嘴鳜优良性状的基因提供了快速的技术 方法。翘嘴鳜的雌性比雄性生长快约20％，因此养殖全雌性的鳜群体的经济效益非常显著。本发明为今后建立高效生产全雌鳜苗种的成套生产技术提供了重要的基础，具有很好的遗传育种价值和推广应用前景。

附图说明

图1为雌核发育鳜。

图2为普通翘嘴鳜(♀)。

图3为斑鳜(♂)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

一种异源精子诱导翘嘴鳜人工雌核发育的方法，其主要步骤如下：

S1：冷冻保存斑鳜异源精子：采用Hanks冷冻稀释液对斑鳜精子进行冷冻低温(-24℃)保存，保存期为24h。解冻时，将冷冻精液管在25℃水浴中解冻备用；所述Hanks冷冻稀释液由以下原料配制而成：KCL 0.4g,NaCL 8.00g，NaHCO3 0.35g，KH2PO4 0.06g，Na2HPO4·7H2O 0.09g,Na2HPO4·12H2O0.10g,MgSO4·7H2O 0.10g,MgCL2·6H2O 0.10g,CaCL2 0.14g,Glucose 1.00g；加蒸馏水配至1升；

S2：班鳜精子的遗传失活：解冻后的斑鳜精液，按1：4的比例经Hanks冷冻液稀释后放入一个直径10cm的培养皿中，在冰盒上手动摇匀后连同冰盒一起放置在水平摇床上，然后用两根15W UV紫外照射管充分照射25分钟，照射距离17cm；照射后，将灭活的精液虹吸至一个5mL的Ep管中，放入冰盒中保存；所述紫外照射管照射强度为3396μW(cm3·s)；

S3：获得翘嘴鳜的卵子：2龄以上的性成熟雌鱼通过注射外源催产激素发情后，采用干法将卵子挤入干燥的器皿中，放入冰盒中保存；所述外源催产激素由以下原料在23℃～27℃的温度条件下混合而成：促黄体素释放激素类似物(LRH-A2)4μg/Kg～6μg/Kg和绒毛膜促性腺激素(HCG)800IU/Kg～1200IU/Kg；

S4：启动卵子雌核发育：将S2得到的遗传失活的翘嘴鳜精子与S3得到的翘嘴鳜成熟卵子摇匀混合受精，受精时间30s；

S5：卵子单倍体染色体组加倍：受精后，转移到淡水中进行冷休克处理，水温4℃，时间约20～25min，得到二倍体卵；所述冷休克处理起始时间是在卵 子受精后2-3min；

S6：将S5所得到的二倍体卵转入方形孵化槽中孵化，水温25℃，按普通翘嘴鳜苗培育方法管理，得到翘嘴鳜雌核发育二倍体鱼苗，二倍体雌核发育鱼苗的诱导率为10～25％；

S7：用微卫星标记鉴定雌核发育鱼苗：

将雌核发育后代进行PIT电子标记，取少量尾鳍置于无水乙醇中保存备用。

(1)基因组DNA提取

采用试剂盒法提取基因组DNA，取选取约0.1g翘嘴鳜鳍条组织放入1.5mL Eppendorf管中，加入蒸馏水浸泡1-2h，待酒精充分置换后用剪刀将其剪碎。

向Eppendorf管中加500μL Nucle Lysis Solution及17.5μL 20mg/uL蛋白酶K，充分混匀后于5℃水浴中至组织完全消化。消化期间每隔10min摇晃Eppendorf管以加快消化速度。待组织消化后放入4℃冷冻离心机中，10000rpm/min离心10min。用剪口的枪头轻轻吸取上清液，转入新的Eppendorf管中。加入200ul Protein Precrpitation Solution快速颠倒，置于冰上10min，然后放入4℃冷冻离心机中，10000rpm/min离心10min。用剪口的枪头轻轻吸取上清液，转入新的Eppendorf管中。向上清液中加入600μL的-20℃预冷的异丙醇，轻轻颠倒，10000rpm/min离心10min，弃上清，沉淀DNA。沉淀的DNA用吸头挑出并转入新的Eppendorf管中，然后用70％的酒精洗涤两次，放置在室温下晾干。用300μL TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH＝8.0)溶解沉淀DNA，置-20℃储存备用。1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，分光光度计检测DNA纯度和浓度，-20℃保存。

(2)微卫星标记PCR扩增及检测

利用6对高度多态的翘嘴鳜微卫星标记合成荧光引物(FAM和HEX)，在各自特定的退火温度下进行PCR扩增，PCR扩增体系和反应程序如下，PCR反应体系为25μL：Taq DNA聚合酶0.5μL(1U/μL)，10×Taq Buffer 2.5μL，MgCl₂2.5μL，dNTP 0.5μL，上下游引物各0.5μL(10μmol/L)，DNA 100ng。扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，退火40s(最适退火温度见表1)，72℃延伸45s，38个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后送北京天一辉远公司，利用毛细管电泳方法测试获得微卫星位点的基因型。

表1微卫星引物基本信息(只有14个引物编码)

Tab.1The basic information of the primer

(3)数据处理与统计分析

PCR产物经自动测序仪ABI Prism3730xl(Rox-500standard)测序并用软件GENEMAPPER V.4.0读取等位基因大小。利用软件Cervus 2.0分析各个基因座上的等位基因频率、观测杂合度Ho和期望杂合度He、多态信息含量PIC、非亲权排除率(NEP)和累计非亲权排除率(CEP)，检测微卫星位点是否符合Hardy-Weinberg平衡及各位点无效等位基因频率，再以父母本双盲建模(simulation)模拟运行10000次得到Delta分布值，以每个候选父母的LOD值进行亲权鉴定分析。

(4)利用6个高度多态微卫星标记对三次雌核发育鳜亲本和子代进行遗传分析(第一批雌核发育亲本雌鱼4尾，亲本雄鱼4尾，子代随机取样35尾；第二批雌核发育亲本雌鱼15尾，亲本雄鱼1尾，子代随机取样100尾；第三批雌核发育亲本雌鱼8尾，亲本雄鱼2尾，子代随机取样26尾)，结果显示：

第一批雌核发育鳜鱼子代35尾中有20尾父母本正常交配产生的后代(表2)，15尾雌核发育后代个体，没有父本基因，雌核发育后代占子代个体43％；

第二批雌核发育子代100尾中有2尾为父母本正常交配产生后代(表3)，98尾雌核发育后代个体，没有父本基因，雌核发育后代占98％；

第三批雌核发育鳜鱼36尾中有5尾为父母本正常交配产生后代(表4)，31尾雌核发育后代个体，没有父本基因，雌核发育后代占86％。

这些利用分子生物学方法所进行的亲子鉴定的证据表明，翘嘴鳜雌核发育个体的遗传物质完全来自母本翘嘴鳜，在“受精”中提供失活精子的斑鳜对雌核发育子代没有遗传贡献。

表2第一批雌核发育父母本正常交配鳜后代父本编号及LOD值

表3第二批雌核发育父母本正常交配鳜后代父本编号及LOD值

表4第三批雌核发育父母本正常交配鳜后代父本编号及LOD值

(5)翘嘴鳜雌核发育子代的形态分析

经过6个月养殖，对雌核发育发育翘嘴鳜的形态特征进行了分析。随机取样50尾，测量结果显示，平均体重为750克，生长速度较普通翘嘴鳜快，全年没有发生任何病害，显示抗病能力强。翘嘴鳜雌核发育所有子代(图1)的形态特征都与母本翘嘴鳜相同(图2)，与提供异源精子的斑鳜完全不同(图2)，这进一步证实利用本方法所获得的雌核发育鳜的遗传物质来源于翘嘴鳜。

上面对本发明的较佳实施方式作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。