水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法与流程

本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法。

背景技术：

镉对人体健康有很大的危害，如会引起肾脏功能障碍、骨质疏松症、癌症以及心血管等疾病。水稻大米(籽粒)是稻作区居民人体镉摄入的主要来源。减少水稻籽粒的镉积累对于降低人体cd中毒风险意义重大。已有对于降低籽粒cd浓度的方法主要集中在降低根系cd吸收、降低cd向地上部转运两个方面开展，而对于镉是否能从水稻地上部往根系转运尚无确切证据证实，关于检测镉从水稻地上部往根系转运能力的方法更是未见报道。

一般研究人员研究其他元素从地上部往根部转运较常采用的是往地上部涂抹或者喷洒溶液的方式。如wangetal.(2013)利用自制喷雾器将纳米金属溶液制成喷雾喷在西瓜幼苗叶表面让其吸收，用透明塑料袋遮住根部避免污染，培养数日后收获植株根、茎、叶，烘干消解后通过电感耦合等离子体质谱法和透射电子显微镜等元素分析法检测植株根、茎、叶中均含有相应的纳米金属物质，从而证明大小小于100nm的ntio2、nmgo、nzno和nfe2o3均可通过气孔进入西瓜叶，然后通过茎转运到根部。该方法一方面易使金属溶液滴到或者被雨水冲刷到根系，导致根系的cd非完全来自于地上部的运输。此外，由于cd是植物的非必需元素，植物叶片对于涂抹在上面的cd的吸收极为有限，能够向下转运的量则更少，导致开展研究的难度非常高。

除了涂抹的方法以外，有研究者利用两室分根装置研究金属元素由植物地上部往植物根系的转运，如wangetal.(2012)采用分根装置和水培方法研究纳米cuo在玉米体内由上往下的转运。实验将玉米根系分为两部分，分别放置在分根装置左右两侧(分根装置为左右不连通，无法进行离子交换的两室装置)，左室为不加纳米cuo的去离子水，右室为纳米cuo溶液，培养一段时间后，与对照相比，检测到左侧根中含有高浓度cu，又检测到玉米叶子中含有纳米cuo，结合高分辨率的透射电子显微镜观察证实纳米cuo可以通过韧皮部由玉米的地上部转运到根系。该研究成功证明纳米cuo可以由玉米的地上部往根系转运，但是该方法无法区分纳米cuo是经过玉米植株的根茎节点位置亦或是经过根茎节点以上其他部位往下转运的能力情况。

综上可见，现有技术存在以下缺陷：采用往地上部涂抹或者喷洒溶液的技术手段研究元素由上往下的转运，往往会因溶液往下流动容易造成根系的污染，难以保证根系检测到的镉是由地上部向下转运而来；此外，因植物一般是利用根系吸收各类元素；叶片虽也能吸收部分元素，叶片表面的蜡质层和角质层会阻碍元素的吸收，导致地上部目标元素含量低，而能够向下转运的量更少，检测难度大，不利于研究的深入。采用传统的分根技术能够检测元素是否能由地上部往根系转运，也能估算向下转运的总量，但是无法区分经过根茎节点位置以及其他位置向根系转运的比例。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法，该方法能够检测水稻根茎节点、根茎节点之上位置向根系转运的重金属。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法，其包括以下步骤：

(1)将水稻苗a的根系平均分成两份，沿着分根界线从水稻苗a的茎的基部往上切割，将水稻苗a的根茎节点割开；

(2)将步骤(1)分成的两份根系分别置于分根培养装置a的第一培养室和第二培养室中，进行分根培养，切割所得到的新节点位于分根培养装置a的中间隔层顶部的正上方；所述分根培养装置a的第一培养室中装有不含重金属的营养液，其第二培养室中装有含浓度为e重金属的营养液；除是否含重金属的区别之外，所述分根培养装置a的第一培养室和第二培养室的营养液成分相同；所述第一培养室和第二培养室的营养液体积相同，所述第一培养室和第二培养室的营养液液面均位于所述割开的根茎节点下方；

(3)分根培养后，收获水稻苗a的两份根系，收获的根系经干燥、消解后，采用原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法检测两份根系中的重金属含量；分根培养装置a的第一培养室中培养的根系所含的重金属浓度为a，分根培养装置a的第二培养室中培养的根系所含的重金属浓度为b。其中，a与b的比值为a1，a1指示水稻根茎节点之上的植物地上部分向水稻根系转运重金属的能力系数。

上述分根培养装置a的第一培养室和第二培养室中的营养液，其所含成分除了重金属外，其他成分完全相同。分根培养装置a的第一培养室中不含重金属，第一培养室中根系检测到的重金属是与第二培养室中的根系相连的地上部往下转运所致。本发明对根茎节点进行切割，阻断了重金属暴露根系吸收的重金属通过根茎节点直接转运到另外一侧根系的路径，分根培养装置a的第一培养室根系中的重金属由根茎节点之上的地上部往根系转运得到。联合使用分根培养和切割技术，本发明能够检测水稻根茎节点、根茎节点之上位置向根系转运的重金属。

另外，一般检测金属或其他元素由植物体地上部往根系转运的常规技术手法是往地上部喷洒或者涂抹溶液，这样的方法虽能直观验证，但是容易造成污染，而且叶子表面的蜡质层和角质层对金属或者其他元素的渗透会造成阻碍作用，尤其是单子叶植物。相较于此，本发明能够较大程度上避免污染问题，而且能够有效吸收镉，便于检测。

作为本发明所述水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，沿着分根界线从水稻苗a的茎的基部往上切割2.0～3.0cm。切割太长(大于3cm)对植物影响大，例如3.5cm时水稻长势不好(植株高度明显减少)，大于6cm时植株在培养两周后死亡；切割太短，则没法分开节点，发明人发现，若切割长度小于2.0cm，随着水稻的生长，根茎节点分离处的空间(即切割间隙)会被新生的植物组织(类似“连接桥”的结构)填满，则失去了“分割”的意义。

作为本发明所述水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法的更优选实施方式，所述步骤(1)中，沿着分根界线从水稻苗a的茎的基部往上切割2.5cm。选择切割的长度为2.5cm，这样即可以保证将切割所得到的新节点卡在分根装置的中间隔层顶部的正上方的时候不折损水稻茎，又可以保证不因过多切割而造成对水稻茎的过度损伤，还可以保证切割后的分根培养过程中，根茎节点分离处的空间(即切割间隙)不会长出新生的植物组织。

作为本发明所述水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法的优选实施方式，所述重金属为镉元素。

作为本发明所述水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法的优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：在不切割的条件下，将水稻苗b的根系平均分成两份，将分成的两份根系分别置于分根培养装置b的第一培养室和第二培养室中，进行分根培养，水稻苗b的根茎节点位于分根培养装置b的中间隔层顶部的正上方；所述水稻苗b与水稻苗a在相同的条件下培育所得，所述分根培养装置b的第一培养室中装有不含重金属的营养液，其第二培养室中装有含重金属浓度为e的营养液；所述分根培养装置b的第一培养室的营养液的成分、体积均与所述分根培养装置a的第一培养室的营养液相同，且所述分根培养装置b的第二培养室的营养液的成分、体积均与所述分根培养装置a的所述第二培养室的营养液相同。分根培养后，收获水稻苗b的两份根系，收获的根系经干燥、消解后，采用原子吸收光谱法或电感耦合等离子体质谱法检测两份根系中的重金属含量；分根培养装置b的第一培养室中培养的根系所含的重金属浓度为c，分根培养装置b的第二培养室中培养的根系所含的重金属为浓度d；其中，c与d的比值为a2，a2指示水稻根茎节点以及水稻根茎节点之上的植物地上部分向水稻根系转运重金属的能力系数，a2-a1指示水稻的根茎节点位置向根系转运重金属的能力系数。

上述分根培养装置b的第一培养室和第二培养室中的营养液，其所含成分除了重金属外，其他成分完全相同；并且分根培养装置b的第一培养室和分根培养装置a的第一培养室装有同样的营养液，分根培养装置b的第二培养室和分根培养装置a的第二培养室装有同样的营养液。分根培养装置b的第一培养室中不含重金属，其第一培养室中根系检测到的重金属是与第二培养室中根系相连的根茎节点以及其上的地上部往下转运所致。通过分根培养装置b，可以检测重金属经过根茎节点位置以及其上的位置向根系转运的量，进一步获知转运到第一培养室的重金属中，分别通过根茎节点、根茎节点之上部位转运所占的比例，从而判断其由上往下转运的能力。

作为本发明所述水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法的优选实施方式，所述水稻苗a和水稻苗b的培育方法为：在分根培养之前，选取水稻种子，消毒后铺种在培养皿中湿润的纱布上，再用锡纸包裹并放入培养箱中催芽，待水稻苗长至2-4cm长(优选3cm)后，在根系避光的条件下水培一个月直至水稻苗长至30cm-50cm，优选为40cm。水稻苗如果太小，则不便分根，且幼嫩的根系对重金属的耐性低因而无法耐受高浓度的重金属，另外后续分根培养后收获的根系样品量少，不利于进行后续重金属含量测定。如果水稻苗太大，则根系活力明显降低，同时也会增加工作人员的时间成本和装置成本。

作为本发明所述水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法的优选实施方式，所述水稻苗a和水稻苗b的分根培养过程中，每三天更换一次营养液。

本发明还提供了一种筛选具有提高的重金属由根茎节点之上的植物地上部向根系转运能力的水稻品种的方法，所述方法包括：(1)将待筛选的多个水稻品种种子消毒后铺种在培养皿中湿润的纱布上，再用锡纸包裹并放入培养箱中催芽，待水稻苗长至2-4cm长后，在根系避光的条件下水培一个月直至水稻苗长至30-50cm；(2)对于每个品种的水稻苗，按照如上文所述的对根茎节点进行切割的分根培养法进行分根培养(切割处理组)，计算每个水稻品种的a与b的比值a1，并在品种间进行a1值的比较；(3)选取a1值最高的水稻品种作为具有提高的重金属由根茎节点之上的植物地上部向根系转运能力的水稻品种。

本发明还提供了一种筛选具有提高的重金属由根茎节点位置向根系转运能力的水稻品种的方法，所述方法包括：(1)将待筛选的多个水稻品种种子消毒后铺种在培养皿中湿润的纱布上，再用锡纸包裹并放入培养箱中催芽，待水稻苗长至2-4cm长后，在根系避光的条件下水培一个月直至水稻苗长至30-50cm；(2)对于每个品种的水稻苗，按照如上文所述的对根茎节点进行切割的分根培养法进行分根培养(切割处理组)以及对根茎节点不进行切割的分根培养法进行分根培养(不切割对照组)，计算每个水稻品种的a1值、a2值以及a2-a1值，并在品种间进行a2-a1值比较；(3)选取a2-a1值最高的水稻品种作为具有提高的重金属由根茎节点位置向根系转运能力的水稻品种。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明联合使用分根培养和切割技术，这样能够检测水稻根茎节点之上的植物地上部分(也即除了根茎节点位置之外的植物地上部)向根系转运的重金属；本发明进一步通过分根培养，检测重金属经过根茎节点位置以及根茎节点之上的植物地上部向根系转运的量，结合切割技术可得知重金属分别通过根茎节点和节点之上的植物部分的转运的能力。根据本发明的检测结果，可较好地判断水稻中重金属分别通过根茎节点及以上位置从地上部向根系转运的能力，这将为探讨重金属从地上部向下转运的路径及机理提供便利，对于后续良种选育技术筛选向下转运能力强的水稻品种或者利用基因工程技术提高cd向下转运能力具有重要的指导意义。

附图说明

图1为在分根培养前，本发明水稻种子水培一个月后所得的水稻苗的照片图；

图2为本发明水稻苗不切割分根培养的示意图；

图3为本发明水稻苗切割后分根培养的示意图；

图4为本发明水稻苗不切割分根培养15天后的长势图；

图5为本发明水稻苗切割分根培养15天后的长势图；

图6为本发明水稻苗切割分根培养15天后，分根培养a1组(0μm/0μm组)节点长势图；

图7为本发明水稻苗切割分根培养15天后，分根培养a2组(0μm/30μm组)节点长势图；

图8为本发明水稻苗切割分根培养15天后，分根培养a3组(30μm/30μm组)节点长势图；

图9为本发明水稻苗不切割分根培养15天后，分根培养b1组(0μm/0μm组)根系长势图；

图10为本发明水稻苗不切割分根培养15天后，分根培养b2组(0μm/30μm组)组根系长势图；

图11为本发明水稻苗不切割分根培养15天后，分根培养b3组(30μm/30μm组)组根系长势图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将以水稻中重金属镉从地上部向根系转运的检测为例，结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明中的水稻的“地上部”是指水稻的根茎节点及其以上的部位(如茎、叶)，而本发明中的水稻的“根系”或“地下部”是指水稻根茎节点以下的部分；本发明中，水稻根茎节点之上的植物地上部分即指除了根茎节点位置之外的植物地上部。

实施例1

本发明水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法的一种实施例，本实施例所述水稻中重金属从地上部向根系转运能力的检测方法为：

1、材料培养

选取大小一致的饱满黄华占水稻种子，用30％的过氧化氢将水稻种子消毒15分钟，然后铺种在培养皿中湿润的纱布上，再用锡纸包裹放入28℃培养箱中催芽(每天换纯水，保证水能没过水稻幼苗根部，不能淹没水稻幼苗)待水稻苗长至3cm左右长度后，转移至500ml避光(锡纸包裹或黑色胶带包裹)塑料杯(塑料杯采用平盖奶茶杯，杯盖剪3-4个直径为1.5cm的圆孔放置水稻，用棉花固定)中进行水培，并放置在25℃-30℃自然条件下(温室)培养，每三天更换一次营养液，培养一月后(水稻种子水培一个月后所得的水稻苗如图1所示)开始进行分根镉处理。其中，采用的营养液为木村b营养液，木村b营养液的母液配方如表1所示，使用时，按照1:1000的比例向该母液中加贮液，用hcl调节ph值至5.6。

表1木村b营养液的母液配方

2、分根实验

分根实验在分根培养装置中进行，分根培养装置由1230ml方形塑料盒制成，两个塑料盒组成一个分根培养装置，这两个盒子即为分根培养装置的第一培养室和第二培养室。实验分为分根培养a组(切割后分根培养)和分根培养b组(不切割分根培养)，分根培养a组的包括分根培养a1组、分根培养a2组、分根培养a3组3个镉浓度不同的处理组，分根培养b组包括分根培养b1组、b2组、b3组3个镉浓度不同的处理组，且每个培养组3个重复。

分根培养a组(切割后分根培养)的处理方法为：将水稻苗a的根系平均分成两份，沿水稻茎基部(即根茎节点位置)的分根界线纵向向上切割2.5cm，将水稻苗a的根茎节点割开；将分成的两份根系分别置于分根培养装置a的第一培养室和第二培养室中，进行分根培养，切割所得到的新节点位于分根培养装置a的中间隔层的顶部的正上方。分根培养a1组(0μm/0μm组)中，其第一培养室和第二培养室中均装有不含重金属的营养液；分根培养a2组(0μm/30μm组)中，其第一培养室中装有不含重金属的营养液，其第二培养室中装有含30μm重金属镉的营养液；分根培养a3组(30μm/30μm组)中，其第一培养室和第二培养室中均装有含30μm重金属镉的营养液。

分根培养b组(不切割分根培养)的处理方法为：将水稻苗b的根系平均分成两份，将分成的两份根系分别置于分根培养装置b的第一培养室和第二培养室中，进行分根培养，水稻苗b的根茎节点位于分根培养装置b的中间隔层的顶部的正上方。分根培养b1组(0μm/0μm组)中，其第一培养室和第二培养室中均装有不含重金属的营养液；分根培养b2组(0μm/30μm组)中，其第一培养室中装有不含重金属的营养液，其第二培养室中装有含30μm重金属镉的营养液；分根培养b3组(30μm/30μm组)中，其第一培养室和第二培养室中均装有含30μm重金属镉的营养液。

上述每个分根培养装置有两株水稻，每个培养室中均装有1000ml木村b营养液(含镉或不含镉)。其中，0μm/0μm组和30μm/30μm组起对照作用。每三天更换一次营养液，在15d时收获分根水稻左右两侧水稻。

水稻苗不切割分根培养的示意图如图2所示；水稻苗切割后分根培养的示意图如图3所示；水稻苗不切割分根培养15天后的长势如图4所示；水稻苗切割分根培养15天后的长势如图5所示；水稻苗切割分根培养15天后，分根培养a1组(0μm/0μm组)节点长势如图6所示；水稻苗切割分根培养15天后，分根培养a2组(0μm/30μm组)节点长势如图7所示；水稻苗切割分根培养15天后，分根培养a3组(30μm/30μm组)节点长势如图8所示；水稻苗不切割分根培养15天后，分根培养b1组(0μm/0μm组)根系长势如图9所示；水稻苗不切割分根培养15天后，分根培养b2组(0μm/30μm组)组根系长势如图10所示；水稻苗不切割分根培养15天后，分根培养b3组(30μm/30μm组)组根系长势如图11所示。

3、样品处理与根系镉含量测定

收获根时，先收获0μm/0μm组，再收获0μm/30μm组，最后30μm/30μm组，其中0μm/30μm组先收获0μm一侧根，再收获30μm一侧根。以上收获顺序能避免镉污染。

收获水稻根后，对其根进行烘干，然后称其干重后粉碎，消解后测量其镉浓度。消解的方法为：使用消解仪消解样品，称取适量粉末0.1g，加入溶样杯中，再加入浓硝酸5ml(使得样品在高温高压下消化分解)，再加入1ml30％过氧化氢(氧化脱色，提高压强，加速消解)。消解过后，当温度降至80℃后取出，过滤，定容至10ml。

消解仪程序方法设置：

消解使用微波消解仪(wx-8000，上海屹尧仪器科技发展有限公司)，测定镉含量使用火焰原子分光光度计，镉含量的测定结果表2所示，水稻中重金属镉从地上部向根系的转运比率统计结果如表3所示。

表2

表3

表3中，地上部总转运能力系数，也即水稻根茎节点以及水稻根茎节点之上的植物地上部分向水稻根系转运重金属的能力系数，其数值等于分根培养b2组(0μm/30μm组)的第一培养室中根系的镉浓度(c)与分根培养b2组的第二培养室中根系的镉浓度(d)的比值。

表3中，根茎节点之上部位转运能力系数，也即水稻根茎节点之上的植物地上部分向水稻根系转运重金属的能力系数，或者说是除水稻根茎节点之外的植物地上部分向水稻根系转运重金属的能力系数，其数值等于分根培养a2组(0μm/30μm组)的第一培养室中根系的镉浓度(a)与分根培养a2组的第二培养室中根系的镉浓度(b)的比值。

表3中，根茎节点转运能力系数，也即水稻根茎节点位置向水稻根系转运重金属的能力系数，其数值等于(c/d)-(a/b)。

由表2和表3可知，从根系吸收的cd向上转运之后，有浓度比为26.47％的镉能通过地上部(包括根茎节点(25.89％)以及根茎节点以上部位(0.58％))再转运到另外一侧不加镉的根系。根茎节点是镉从水稻地上部往根系转运的主要部位。

水稻根部吸收镉中的一部分会再由地上部转运回到根系，这样可以避免全部吸收的镉都进入地上部转运到籽粒中被人体食用。另外检测到有95％以上发生转运的镉都会在根茎节点处直接转运回根部。因镉会对地上部细胞中叶绿体的结构功能造成破坏、阻碍叶绿素的合成、干扰蒸腾作用、也会对叶片的生理活性产生影响，进而影响水稻干物质的积累，导致水稻产量和品质的降低，所以这部分直接经过节点就转运回根系的镉不会对地上部的茎、叶产生伤害，也会相应减少对水稻产量的影响。

之前对于降低籽粒cd浓度的研究主要从(1)降低根系cd吸收，(2)降低根部cd向地上部转运两个方面开展，而目前关于镉是否能从水稻地上部往根系转运还无人证实，分别由节点和节点以上部位的转运情况更是无人研究。从整体上来说，能够阐释清楚cd从土壤最终进入籽粒的完整过程(包括吸收、向上运输、向下转运)，是最终通过基因工程手段以及育种(包括传统育种与分子育种)降低籽粒cd浓度的前提条件。而理解cd从地上部向下转运的过程对于利用基因工程技术提高cd向下转运能力或者通过良种选育选育出从地上部向根系转运能力强的品种来降低籽粒cd浓度方面具有重要作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。