一种改良黄颡鱼生长性状的复合育种方法与流程

本发明涉及一种改良黄颡鱼生长性状的复合育种方法，属于黄颡鱼遗传育种领域。
背景技术：
：黄颡鱼(pelteobagrusfulvidraco)隶属于鲇形目(siluriformes)、鲿科(bagridae)、黄颡鱼属(pelteobagrus)，是我国重要的水产养殖品种，在长江水系广为分布，是我国较重要的底层小型经济鱼类。由于肉味鲜美，肉质细嫩，营养丰富，肌间刺少，离水后可存活一段时间，可鲜活上市，已越来越受到我国人民的喜爱和欢迎，并保持较高的市场需求和销售价格。因此，已成为我国很有养殖前途的主导品种之一。目前，随着黄颡鱼养殖规模的扩大，该鱼开始出现种质退化、生长个体变小、抗逆性变差等现象，急需对黄颡鱼进行遗传改良，培育出生长速度快、当年苗种能长到商品规格、适应性强的黄颡鱼新品系(种)来满足市场需求。鉴于杂交育种已成为提高鱼类产量和改善鱼类品质的重要手段，目前已有关于黄颡鱼×乌苏里拟鲿、黄颡鱼×粗唇鮠、黄颡鱼×瓦氏黄颡鱼远缘杂交和黄颡鱼和yy超雄黄颡鱼选育的相关报道。黄颡鱼雌鱼和yy超雄黄颡鱼雄鱼的子代(“全雄1号”黄颡鱼)已达到规模化繁育水平，但其生产成本过高，已报道的黄颡鱼雌鱼和瓦氏黄颡鱼雄鱼杂交子代体型厚实，生长优势极其显著，但同时也存在受精率低、畸形率高、孵化率低的问题。鉴于近些年全国各地繁养殖户对杂交黄颡鱼的认可和市场需求的不断扩大，有必要对现在已有的关于黄颡鱼雌鱼和瓦氏黄颡鱼雄鱼杂交制种技术进一步改良。技术实现要素：发明目的：针对上述技术问题，本发明对现有的一种黄颡鱼雌鱼和瓦氏黄颡鱼雄鱼杂交育种方法进行改进，通过对亲本的群体选育，并用微卫星标记和金属数码芯片技术筛选出供杂交繁育的亲本，保证了杂交黄颡鱼的生长性状和杂种优势均高于普通黄颡鱼，为黄颡鱼新品种的培育提供了一条新的途径。技术方案：本发明公开了一种改良黄颡鱼生长性状的复合育种方法，包括以下步骤：首先，通过二代群体选育获得优质的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼亲本库；接着利用微卫星标记检测黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼亲本，挑选遗传相似度在90％以上的亲本个体作为繁殖群体；然后以黄颡鱼雌鱼为母本，瓦氏黄颡鱼雄鱼为父本进行杂交制种。优选，所述二代群体选育的方法为：选择不同来源的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼通过人工催产和人工授精，分段培育到至少2龄，培育分三阶段选择，第一阶段选择率60％，第二阶段分雌雄选择，选择率50％，第三阶段选择率40％。总选择率为1.2％；将一代选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼按上述方法再选择一次，得到二代选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼群体。优选，所述利用微卫星标记检测黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼亲本，挑选遗传相似度在90％以上的亲本个体作为繁殖群体的方法为：使用seqidno:1～41所示的扩增引物，分别以选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组dna为模板进行荧光pcr扩增，经基因分析仪进行基因型分析，利用cervus3.0等软件对所选微卫星进行群体遗传多样性分析和聚类图的构建，筛选出遗传相似度在90％以上的亲本个体作为繁殖群体。优选，所述黄颡鱼雌鱼与瓦氏黄颡鱼雄鱼杂交制种配比比例数量为300:2。优选，所述杂交制种过程中包括亲本培育、亲本选择、亲本催产、人工授精、人工孵化和鱼苗培育及养成。进一步优选，所述亲本选择的标准为：二代选育的黄颡鱼繁殖群体至少1000尾，其中黄颡鱼雌鱼体质量不低于80g；二代选育的瓦氏黄颡鱼繁殖群体至少200尾，其中瓦氏黄颡鱼雄鱼体质量不低于500g。进一步优选，所述亲本催产的方法为：对黄颡鱼雌鱼和瓦氏黄颡鱼雄鱼采用激素药物外源注射法进行人工催产。具体的育种方法如下：1、黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的群体选育选择不同来源的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼通过人工催产和人工授精，分段培育到至少2龄，培育分三阶段选择，第一阶段选择率60％，第二阶段分雌雄选择，选择率50％，第三阶段选择率40％。总选择率为1.2％(见图1和图2)。将一代选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼按上述方法再选择一次，得到二代选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼群体。2、黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的遗传检测利用微卫星标记(见表1)对二代选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼群体抽样进行遗传相似度检测，分别挑选出遗传相似度在90％以上的亲本个体作为繁殖群体。表1用于检测黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼亲鱼群体遗传相似度的微卫星引物其中pcr所用的荧光通用引物核苷酸序列为：m13(-21)：5’-tgtaaaacgacggccagt-3’(seqidno.41)。使用在线软件misa(microsatellite,http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)挖掘瓦氏黄颡鱼转录组序列中的微卫星标记；采用primer5.0设计软件对筛选出的ssr序列设计引物，进行pcr扩增，确定各个引物的退火温度。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。pcr体系为20μl体系，包括：dna模板(1μl)，正反引物各(0.8μl)，ddh2o(7.4μl)，2×taqmix(10μl)。pcr扩增的反应程序：95℃预变性5min；32个循环，每个循环包括94℃变性30s，退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min，4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶法检验后，4℃保存。将符合要求的est-ssr引物利用黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的32个体进行pcr扩增，采用8％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证多态性，从中筛选出多态性高的est-ssr位点(见表1)。3、杂交黄颡鱼制种(见图3)(1)亲本培育雌雄亲鱼单养或混养，可适当搭配滤食性鱼类。时间选择在10月份或翌年的3月，水温要求在15℃以上。繁殖季节放养密度以200kg/667m3～400kg/667m3为宜，非繁殖季节放养密度以500kg/667m3～750kg/667m3为宜。保持水质清新，透明度以40cm～50cm为宜，溶氧量达到5.0mg/l以上，催产前的一个月间隔5d～7d冲新水一次，以刺激亲鱼性腺发育。(2)亲本选择选择80克以上体色黄黑间隔明显、活力强的、体型正常，体格健壮，体表光滑、无疾病、无畸形的2龄黄颡鱼雌鱼作为雌性亲本。选择500克以上体表无损伤的、体型正常、活力强的、健康的2龄以上瓦氏黄颡鱼作为雄性亲本。(3)亲本催产水温在22℃～30℃时，选择腹部膨大，仰腹可见卵巢轮廓明显，生殖孔扩张、红肿、宽而圆，用手轻轻挤压鱼腹，腹部松软而富弹性，体色较艳，体型短粗的黄颡鱼雌鱼，体型瘦长，腹部不膨大，生殖突尖而长、末端有细孔呈红色充血状的，体表条纹明显的瓦氏黄颡鱼雄鱼采用激素药物外源注射法进行人工催产。母本的注射量依据水温而定(见表2)，父本注射剂量为母本的30％～50％。水温高于26℃时雄鱼可不注射催产激素。肌肉直射在亲鱼背部肌肉或腹腔注射，注射部位为胸鳍基部或背部肌肉。注射后将亲鱼放入小网箱或面积在4m2～20m2之内，水深0.6m～0.8m的培育池中培育，配备充气式增氧设备。不同水温下的效应时间不同，效应时间的长短依据表3确定。表2黄颡鱼雌鱼在不同水温下的推荐注射次数、针距和剂量表3水温与效应时间的关系水温，℃20～2122～2324～2526～2728～2930～32效应时间，h28～3222～2420～2416～1912～1510～12(4)人工授精轻压雌鱼腹部，泄殖孔中有卵粒流出时，即可人工授精。将成熟度适中的雄性亲本剖腹，取出精巢并剪成碎片，称重后放在孔径0.25mm～0.35mm的金属丝网筛上研磨，滤去精巢组织残渣。每克精巢用5ml，ph＝7.17的精子稀释液(表4)搅拌后在4℃～8℃下避光保存备用。与此同时，将开始排卵的雌性亲本用纱布裹住，使其腹部外露，用手由前向后挤压其腹部，将卵全部挤出，放入已灭菌的干燥玻璃器皿中。取卵子体积约1/3左右浓度为0.8％的生理盐水，将精子放入生理盐水中搅拌3s～5s，激活精子，再放入到卵中搅拌30s～40s进行受精。每1000g卵加入2ml稀释后的精子，受精后的卵均匀地撒在规格60cm×40cm、孔径0.35mm～0.45mm的网片上，转移至孵化池孵化，或经10％～15％的黄泥浆脱粘处理后放入孵化桶孵化。表4精子稀释液配制方法配方剂量nacl7.8gcacl20.21gkcl0.2gnahco30.021g蒸馏水1000ml(5)人工孵化将已粘附卵的鱼巢，使用10ppm高锰酸钾浸泡15min后，置于孵化池中流水充氧孵化或直接放入经清塘消毒后的池塘中孵化；在受精8小时后使用10ppm亚甲基蓝浸泡3min。水泥池静水孵化放卵密度为每立方米水体4×104粒～6×104粒，微流水孵化放卵密度为每立方米水体1.5×105粒～2×105粒。孵化桶孵化放卵密度为每立方米水体1×106粒～1.5×106粒。孵化用水应用网孔尺寸0.25mm的尼龙或乙纶网布过滤，严防敌害生物进入。池水温差≤1.5℃，溶氧在6mg/l以上。70h后移出孵化设备，移至培育池内进行培育。鱼苗孵化时间依水温高低、孵化方式而定(表5)。在鱼苗出膜15h后，将水泥池水位降至30cm左右，孵化桶孵化的鱼苗转移至水泥池暂养。暂养过程保持微流水和充气式增氧。表5水温、孵化方式和脱膜时间的关系(6)鱼苗培育及下塘鱼苗的培育采取分段式培育，第一阶段：鱼苗破膜至全长1cm，放养密度一般为0.5×104尾/立方米～1.5×104尾/立方米。仔鱼脱膜后1～3d不需要进食，3天后投喂3～4克/立方米水体卤虫作为开口饵料。仔鱼开口后，每天进行吸污，日换水1/4～1/3。第二阶段：夏花的培育，放养密度为每亩1.5～2万尾，水花下池后每亩用2㎏～3㎏定点豆浆泼洒一周，5～6d后用粉料成团池塘四周投喂，养殖20天左右，长至3厘米以上，及时分池。第三阶段：幼鱼到成鱼的培育，放养密度为每亩1～1.2万尾，分苗后需要重新驯化饲料。每天投喂前需要抽污，投喂时关气泵。每隔15d～20d加换新水一次，保持水透明度在25cm～30cm之间。也可参照《黄颡鱼养殖技术规程》水产行业标准(ny/t1351-2007)进行养殖。技术效果：相对于现有技术，本发明采用经二代群体选育的黄颡鱼雌鱼和瓦氏黄颡鱼雄鱼可将杂交受精率提高至80％以上，还能减少亲本雄鱼的宰杀数量，提高雄鱼的使用效率，间接性的提高经济效益。对杂交鱼苗采用分段式培育，明显提高了鱼苗的成活率，杂交鱼苗畸形减少至2％以下，杂交黄颡鱼的生长速度比普通黄颡鱼快20％以上，达到改良了普通黄颡鱼的生长性状的目的。附图说明图1：瓦氏黄颡鱼群体选育技术路线图；图2：黄颡鱼群体选育技术路线图；图3：杂交黄颡鱼制种技术路线与工艺图。具体实施方式下面通过具体实施例对本发明所述的技术方案给予进一步详细的说明，但有必要指出以下实施例只用于对
发明内容的描述，并不构成对本发明保护范围的限制。实施例1：一、黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的群体选育选择不同来源的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼通过人工催产和人工授精，分段培育到至少2龄，培育分三阶段选择，第一阶段选择率60％，第二阶段分雌雄选择，选择率50％，第三阶段选择率40％。总选择率为1.2％(见图1和图2)。将一代选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼按上述方法再选择一次，得到二代选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼群体。二、黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的遗传检测利用微卫星标记(见表1)对二代选育的黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼群体抽样进行遗传相似度检测，分别挑选出遗传相似度在90％以上的亲本个体作为繁殖群体。三、杂交黄颡鱼制种(见图3)1、亲本选择2月底，选择2年龄体表无损伤的、体型正常、活力强的、健康的、规格在80克以上选育二代以上的黄颡鱼雌鱼作为雌性亲本。选择3年龄体表无损伤的、体型正常、活力强的、健康的、规格在500克以上选育二代以上的瓦氏黄颡鱼雄鱼作为雄性亲本，在面积20m2，水深1.5m的水泥池塘驯养。早晚各巡塘一次，观察天气、水质变化、亲鱼活动和摄食情况，定期检查性腺发育情况。2、人工催产5月下旬，当水温高于22℃时开始人工催产，选择腹部膨大，仰腹可见卵巢轮廓明显，生殖孔扩张、红肿、宽而圆，用手轻轻挤压鱼腹，腹部松软而富弹性，体色较艳，体型短粗的黄颡鱼雌鱼，体型瘦长，腹部不膨大，生殖突尖而长、末端有细孔呈红色充血状的，体表条纹明显的瓦氏黄颡鱼雄鱼采用激素药物外源注射法进行人工催产。在亲鱼背部肌肉分两次注射。黄颡鱼第一针的注射量为：22μg/kg促黄体素释放激素(lhrh-a2)、3mg/kg马来酸地欧酮(dom)。第二针的注射量为：22μg/kg促黄体素释放激素(lhrh-a2)、10mg/kg马来酸地欧酮(dom)，2200iu/kg绒毛膜促性腺激素(hcg)，瓦氏黄颡鱼的激素用量为黄颡鱼的30％。注射后将亲鱼放入面积为10m2，水深0.6m～0.8m，氧气充足的水泥池中培育，24h后检查催产效果，达到产卵时期进行人工取卵取精。3、人工授精雌性黄颡鱼到达效应期后，取瓦氏黄颡鱼雄鱼，剪断下颌处动脉放血30s，取出精巢，擦干精巢表面液体，称重后放在孔径0.35mm的金属丝网筛上研磨，滤去精巢组织残渣。每克精巢用5ml的精子稀释液加入ph7.17的精子稀释液搅拌后在4℃下避光保存备用。与此同时，将开始排卵的雌性亲本用纱布裹住，使其腹部外露，用手由前向后挤压其腹部，将卵挤入到干燥、干净的容器中。取卵子体积约1/3左右0.5％的生理盐水，将精子放入生理盐水中搅拌5s，激活精子，再放入到卵中搅拌40s进行受精。每500g卵加入2ml稀释后的精子。受精后的卵均匀地撒在规格60cm×40cm、孔径0.35mm～0.45mm的网片上，转移至孵化池孵化。4、人工孵化孵化用水用网孔尺寸0.25mm的尼龙或乙纶网布过滤，严防敌害生物进入。将人工授精卵放入25℃水温的孵化网进行流水孵化，将已粘附卵的鱼巢，使用10ppm高锰酸钾浸泡15min后，置于孵化池中流水充氧孵化；孵化期间为防治受精卵得水霉病，在受精8小时后使用10ppm亚甲基蓝浸泡3min，在出膜前的10小时以上进行“抖卵”，将发霉的卵和死卵，抖掉并用吸管虹吸出来，防止水质变坏，留下好的受精卵等待出膜；将已脱粘的鱼卵放入孵化缸中孵化，放卵密度为每立方米水体1×106粒～1.5×106粒。池水温差≤1.5℃，溶氧在6mg/l以上。在鱼苗出膜15h后，将水泥池水位降至30cm左右，70h后移出孵化设备，移至培育池内进行培育。5、杂交黄颡鱼鱼苗培育及养成鱼苗破膜至全长1cm，放养密度一般为0.5×104尾/立方米～1.5×104尾/立方米。仔鱼脱膜后1～3d不需要进食，3天后按照3～4克/立方米水体投喂卤虫作为开口饵料。仔鱼开口后，每天进行吸污，日换水1/4～1/3。待鱼苗生长至3cm长左右进行分池，放养密度为1.5～2万尾/亩，水花下池后水花下池后每亩用2kg～3kg定点豆浆泼洒一周，5～6d后用粉料成团池塘四周投喂。鱼苗下塘3天后，加注新水10cm～15cm，以后每4d～5d加一次，等水位达到90cm左右时，采取换水方式来调节水质，保持水透明度在25cm～30cm之间。杂交鱼苗养殖到60天左右便可看出其兼具了双亲的优良性状，具有显著杂交优势：体色诱人(偏母本)、生长快速(偏父本)。一冬龄鱼抽样检测30条，杂交黄颡鱼平均规格达到150克以上，平均生长速度比普通黄颡鱼快20％以上(见表6)。表61冬龄杂交黄颡鱼和普通黄颡鱼的体重及形态差异比较体重和形态体征比较杂交黄颡鱼普通黄颡鱼平均体重(g)150.485.6体型生长快，体型大生长慢，体型小吻部吻部突出，呈马蹄型吻钝，呈月牙型胸鳍后缘有锯齿，前缘不太明显前后缘都有锯齿sequencelisting<110>南京师范大学<120>一种改良黄颡鱼生长性状的复合育种方法<130>2017.04<160>41<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1ggactggaacacaacaggct20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2cccaaaccgcacattatttc20<210>3<211>21<212>dna<213>人工序列<400>3gctttttatcatgcagtgtgg21<210>4<211>21<212>dna<213>人工序列<400>4gaaaattcagcatttccaagc21<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5caggctaaccttggcttgac20<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<400>6cagtcccagtcagctctgc19<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列<400>7ccgtacacagttgctctcca20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8caaaacactccagcagtcca20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9ctgtcacactcgccttcaaa20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10ttactcgcagtgcattttgg20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11gctgagaactgaaaccctgc20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12acatggacctcccattgtgt20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13tttcaatggcctcctgattt20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14ttcttccctttttccctcgt20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15gccaagacgacatcacagaa20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16tgtgccaggttgtgtacgtt20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列<400>17tcggtcagttcagatcacca20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18cacacaacacaatctgccaa20<210>19<211>20<212>dna<213>人工序列<400>19gatgaaagaaacccggaaca20<210>20<211>20<212>dna<213>人工序列<400>20tggagagaaagaaggccaga20<210>21<211>20<212>dna<213>人工序列<400>21caacgactggaggtcaaaca20<210>22<211>21<212>dna<213>人工序列<400>22agctgacggaactgttactgc21<210>23<211>20<212>dna<213>人工序列<400>23tgaaatagcttgccgttgtg20<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列<400>24tggattgttgtgaggttgga20<210>25<211>20<212>dna<213>人工序列<400>25gggattagggtgtagggagc20<210>26<211>20<212>dna<213>人工序列<400>26ccctaagttgagcgccttta20<210>27<211>20<212>dna<213>人工序列<400>27tcactaccggggactgactt20<210>28<211>20<212>dna<213>人工序列<400>28taaaaattcaccggccattc20<210>29<211>20<212>dna<213>人工序列<400>29agcattggagccgatcatac20<210>30<211>20<212>dna<213>人工序列<400>30aggcaccctcagtaagagca20<210>31<211>20<212>dna<213>人工序列<400>31agcagcctcttcaaccgtta20<210>32<211>21<212>dna<213>人工序列<400>32caggtagagtgggagtgatgg21<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列<400>33tcaaactgggcaaaaactcc20<210>34<211>20<212>dna<213>人工序列<400>34aacgaagggggttttcagat20<210>35<211>20<212>dna<213>人工序列<400>35ttttctgaaggagacgtcgg20<210>36<211>19<212>dna<213>人工序列<400>36ccaggcaggatggttacct19<210>37<211>20<212>dna<213>人工序列<400>37cttcccagaagtctgaacgg20<210>38<211>20<212>dna<213>人工序列<400>38tccaggatcaggacatcaca20<210>39<211>20<212>dna<213>人工序列<400>39ccactggcaaaacattgaaa20<210>40<211>20<212>dna<213>人工序列<400>40tcagacccgccttaatatgc20<210>41<211>18<212>dna<213>人工序列<400>41tgtaaaacgacggccagt18当前第1页12