一种干细胞滤液蛋白活性的保存方法及冻存保护剂与流程

本发明涉及生物医学美容领域，尤其涉及一种干细胞滤液蛋白活性的保存方法及冻存保护剂。

背景技术

现代生物基因工程技术的长足发展对生命科学的方方面面都产生了影响，同时也给美容化妆品行业都带来了全新的发展机遇，化妆品已经从传统的化学美容、植物美容向生物美容与基因美容发展。生物美容原料也有了较大的发展契机。

人脐带间充质干细胞（humanumbilicalcord-mesenchymalstromalcells，huc-mscs）是一类具有多向分化能力和自我更新能力的干细胞。它在胚胎时期的第4～12天进入华氏胶组织（wharton’sjelly）并且活跃至胎儿娩出。因脐带具有取材容易，不容易被污染，不涉及道德、伦理和法律方面的问题等诸多优点，被广泛用于huc-mscs的提取。同时，人脐带间充质干细胞培养液（上清液）含有大量的具有多种生物活性的蛋白质、多肽及细胞因子，它们能够参与细胞结构的维持运动信息交流以及组织修复与再生，具有较好的抗光老化、抗氧化、抗皱、美白肌肤、伤口愈合、细胞修复等功效。

然而，液态的干细胞培养上清液在常温保存时间短，蛋白活性不高，这就阻碍了它的推广和应用。中国专利申请201510033971.0公开了人脐带间充质干细胞培养上清液活性因子及细胞裂解液的制备方法、产品与应用，该制备方法采用磁性无损分选方法进行健康人脐带间充质干细胞的分选提取，然后进行传代培养，收集2～10代之间全部细胞培养上清液及细胞裂解液，最后经低温真空制备得到细胞培养上清液及细胞裂解液的冻干粉，该发明以冻干粉形式有效地保存了人间充质干细胞培养上清中的各种具有生物活性的细胞因子混合物，为人间充质干细胞培养上清的产业化应用奠定了基础。但是作为一款具有生物活性的原料以冻干粉的方式保存，对所需设备有一定的要求，原料制备需要一定时间，同时使用也不大方便。

技术实现要素：

本发明实施例提供了一种干细胞滤液蛋白活性的保存方法及冻存保护剂，干细胞滤液蛋白活性的保存方法操作简单，成本低，同时能够保证蛋白活性不受影响。

为达到上述目的，本发明实施例采用如下技术方案：

第一方面，本发明实施例提供一种干细胞滤液蛋白活性的保存方法，包括：

获取低传代倍数的细胞培养上清液；

对低传代倍数的细胞培养上清液进行超浓缩，获得细胞浓缩液；

在细胞浓缩液中加入冻存保护剂，其中，冻存保护剂为1%（m/v）的甘露醇和0.5%（m/v）海藻糖。

进一步地，在细胞浓缩液中加入冻存保护剂，具体包括：

将甘露醇和海藻糖用超纯水加热至80℃溶解，并冷却至室温，得到冻存保护剂，其中，甘露醇和海藻糖的用量分别为滤液终体积的1%（m/v）和0.5%（m/v）；

将冻存保护剂加入细胞浓缩液中。

进一步地，获取低传代倍数的细胞培养上清液，具体包括：

分离提取健康的人脐带间充质干细胞；

对人脐带间充质干细胞进行体外培养、扩增，收集低传代倍数的细胞培养上清液。

进一步地，对人脐带间充质干细胞进行体外培养、扩增，收集低传代倍数的细胞培养上清液，具体包括：

将p1代人脐带间充质干细胞在50ml培养瓶中培养，当生长到90％汇合度时，消化，废弃含血清的培养基，并使用不含血清的培养基继续扩大培养；传代时，收集不含血清的培养基并与等体积的新鲜的不含血清培养基混合，继续用于细胞的扩大培养，如此反复至细胞传代至10代，收集全部细胞培养上清液。

进一步地，人脐带间充质干细胞的传代倍数在2-10代之间。

进一步地，对低传代倍数的细胞培养上清液进行超浓缩，获得细胞浓缩液，具体包括：

对低传代倍数的细胞培养上清液采用0.22μm滤膜过滤；再通过30kd超滤膜，收集透析液；将透析液通过3kd超滤膜，收集得到细胞浓缩液。

第二方面，本发明实施例提供一种干细胞滤液蛋白活性的冻存保护剂，干细胞滤液蛋白活性的冻存保护剂应用于如第一方面中任意一项的干细胞滤液蛋白活性的保存方法，干细胞滤液蛋白活性的冻存保护剂为1%（m/v）的甘露醇和0.5%（m/v）海藻糖。

根据上述方法进行制备得到的一种人脐带间充质干细胞滤液，可以在具有生物学活性功能的产品中应用。检测滤液中的蛋白活性，主要通过检测抗氧化活性实现。按照实验方案，成纤维细胞给予样品，孵育24h后，检测相关抗氧化基因的变化，从而确保滤液的抗氧化能力，进而反应其蛋白活性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：将细胞浓缩液添加1%（m/v）甘露醇与0.5%（m/v）的海藻糖配伍作为冻存保护剂，细胞浓缩液可以作为一种原料使用，直接放于-20℃长期保存，保存方法简单且蛋白活性不受影响，设备要求不高，细胞浓缩液即使是以试剂的形态保存，保存时间也可以长达12个月。具体使用时，37℃水浴快速回温溶解即用。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种干细胞滤液蛋白活性的保存方法的流程示意图；

图2为本发明实施例提供的一种各基因的具体变化趋势示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行详细地描述。

实施例1

本发明实施例提供一种干细胞滤液蛋白活性的保存方法，如图1所示，该干细胞滤液蛋白活性的保存方法具体包括：

s101、获取低传代倍数的细胞培养上清液。

具体的，步骤s101可以包括：步骤a和步骤b：

步骤a、分离提取健康的人脐带间充质干细胞。

步骤b、对人脐带间充质干细胞进行体外培养、扩增，收集低传代倍数的细胞培养上清液。

具体的，步骤b可以按照下述步骤实现：将p1代人脐带间充质干细胞在50ml培养瓶中培养，当生长到90％汇合度时，消化，废弃含血清的培养基，并使用不含血清的培养基继续扩大培养；传代时，收集不含血清的培养基并与等体积的新鲜的不含血清培养基混合，继续用于细胞的扩大培养，如此反复至细胞传代至10代，收集全部细胞培养上清液。

s102、对低传代倍数的细胞培养上清液进行超浓缩，获得细胞浓缩液。

具体的，步骤s102可以按照下述步骤实现：对低传代倍数的细胞培养上清液采用0.22μm滤膜过滤；再通过30kd超滤膜，收集透析液；将透析液通过3kd超滤膜，收集得到细胞浓缩液。

s103、在细胞浓缩液中加入冻存保护剂，其中，冻存保护剂为1%（m/v）的甘露醇和0.5%（m/v）海藻糖。

还需要说明的是，人脐带间充质干细胞的传代倍数在2-10代之间。

示例性的，本发明实施例提供一种干细胞滤液蛋白活性的保存方法可以包括：

(1)ucmscs的分离与培养

取新生儿脐带(长度不少于15cm)数根，置脐带保存液，4℃储存(时间不超过8小时)。超净台内取出脐带，75％乙醇消毒脐带表面2-3min，剪开两端结扎丝线，生理盐水充分洗涤残留的血液，将脐带剪成2cm小段，再次漂洗，剖开脐带，剔除脐静脉、脐动脉，剥离华通氏胶。将华通氏胶剪成1mmx1mmx1mm大小，接种于含10%fbs的α-mem培养皿内，放入37℃、5％co2培养箱中培养，整个过程严格无菌操作。倒置显微镜每天观察细胞生长情况。

结果显示：1～2d见组织块部分贴壁，6d左右组织块周围有细胞爬出，10d左右细胞已有成片聚集。细胞多为双突起的长梭形、短棒状或扁平形的成纤维样细胞，核仁明显。待细胞融合达80-90％，此时消化、传代，去除组织块，用不含血清的α-mem培养基。传代后细胞生长能力明显增强，至p2代以后，隔天细胞即需传代。

(2)培养上清液的收集：

p0代人间充质干细胞在10cm培养皿中培养(含有10%fbs的α-mem)，当生长到80-90％汇合度时，废弃培养基，用不含血清的α-mem培养基传代培养，p1代以后收集培养上清液，并与等体积的新鲜培养基混合，继续用于细胞的扩大培养，如此反复至细胞传代至10代，收集全部细胞培养上清液，用于后续干细胞滤液的制备；

(3)干细胞滤液的制备：

对收集的无血清上清液先采用0.22μm滤膜过滤，去除混在上清液中的细胞碎片；再采用分级无菌超滤分离机进行截留。

培养上清液通过滤膜的顺序为，先通过30kd有机滤膜，收集低于30kd的干细胞滤液；然后将滤液用泵再次打入3kd有机滤膜，收集到1l-2l滤液，根据需要，通过反复过滤可以将滤液体积浓缩为原培养上清液体积的1/10-1/50，即制备得到人脐带间充质干细胞滤液。

将药用级甘露醇和海藻糖用超纯水加热至80℃溶解，用量分别为滤液终体积的1%（m/v）和0.5%（m/v）,冷却至室温（25℃），加入干细胞滤液中，混合均匀，置于-20℃长期保存。

使用时，37℃水浴快速溶解即用。

将干细胞滤液、干细胞滤液+0.5%海藻糖、干细胞滤液+1%甘露醇+0.5%海藻糖于-20℃冻存。1个月后，37℃水浴快速溶解，检测干细胞滤液的抗氧化活性（蛋白活性）。qrt-pcr检测具体实验步骤：

a)将成纤维细胞接种于6孔板中，待铺板率达到60%时，即可进行给药试验；

b)实验组采用既定的药物浓度（如表1）刺激，对照组（阴性组）采用空白培养液进行孵育。在孵育后24h收集细胞；

c)按照trizol试剂说明书（invitrogen）进行rna提取；

d)按照反转录试剂盒操作说明书（takara）进行rna反转录、并在此基础上，对拟选用的4种基因（cu/zn-sod、mn-sod、cat、gsh-px）进行qrt-pcr检测；

e)所得数据采用2-δδct计算方法进行统计分析。

表1实验分组及给药方法

实验结果如下：

与对照组和阳性对照组相比，抗氧化基因的扩增倍数如表2所示（示意数据），各基因的具体变化趋势如图2所示。

表2.药物刺激24h后基因扩增倍数

其中，cu-sod为铜超氧化物歧化酶；mn-sod为锰超氧化物歧化酶；cat为过氧化氢酶；gsh-px为谷胱甘肽过氧化物酶。

与对照组相比，2号液、3号液不同程度的上调sod家族基因，cu-sod、mn-sod、cat、gsh-px分别上调1.43、1.84倍；1.85、2.02倍；1.24、1.34倍；1.63、1.52倍，且均有显著性差异，有统计学意义。

因此，与不做任何处理直接保存相比，添加1%甘露醇和0.5%海藻糖蛋白活性更好。

将该人脐带间充质干细胞滤液与其他辅料或者试剂、保健物质等结合，得到具有生物学活性功能的产品。

实施例2

本发明实施例还提供一种，干细胞滤液蛋白活性的冻存保护剂，干细胞滤液蛋白活性的冻存保护剂应用于如实施例中任意特征的干细胞滤液蛋白活性的保存方法，干细胞滤液蛋白活性的冻存保护剂为1%（m/v）的甘露醇和0.5%（m/v）海藻糖。

本发明实施例提供一种干细胞滤液蛋白活性的保存方法及冻存保护剂，该干细胞滤液蛋白活性的保存方法包括：获取低传代倍数的细胞培养上清液；对低传代倍数的细胞培养上清液进行超浓缩，获得细胞浓缩液；在细胞浓缩液中加入冻存保护剂，其中，冻存保护剂为1%（m/v）的甘露醇和0.5%（m/v）海藻糖。根据上述方法进行制备得到的一种人脐带间充质干细胞滤液，可以在具有生物学活性功能的产品中应用。检测滤液中的蛋白活性，主要通过检测抗氧化活性实现。按照实验方案，成纤维细胞给予样品，孵育24h后，检测相关抗氧化基因的变化，从而确保滤液的抗氧化能力，进而反应其蛋白活性。与现有技术相比，本发明的有益效果是：将细胞浓缩液添加1%（m/v）甘露醇与0.5%（m/v）的海藻糖配伍作为冻存保护剂，细胞浓缩液可以作为一种原料使用，直接放于-20℃长期保存，保存方法简单且蛋白活性不受影响，设备要求不高，细胞浓缩液即使是以试剂的形态保存，保存时间也可以长达12个月。具体使用时，37℃水浴快速回温溶解即用。

上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。