本发明涉及一种克服百合种间杂交障碍的杂交方法，通过适宜的杂交方法、恰当的胚抢救时间与适当的胚抢救方法，为培育新颖种间杂交品种提供技术支持；本发明属于农业生物技术，尤其属于园林植物与观赏园艺领域；
背景技术：
百合是百合科，百合属多年生球根草本植物；百合花大，色彩丰富，花姿优美，既能作切花，盆花,又能在园林绿地中应用；既可观赏,又可食用和药用,深受人们的喜爱；其被划分成6个种群：1、东方百合:是基于天香百合和鹿子百合形成的区群，也包含多种亚洲百合的杂交种；花芬芳，向外伸展，植株往往高大，花朵可能会很大；2、麝香百合:为麝香百合原种和亚种的栽培种，是重要的切花材料，与其他杂交种相比较少种植于庭园中；3、亚洲百合:品种常为中型植物，花直立向外，无香气，是由东亚和中亚的百合原生种形成；4、山丹百合：因叶细而多，花冠似珊瑚得名；株秆高30～40cm，茎上生叶50～80cm，细小纤弱，狭长如松叶；5、卷丹百合：因花色火红，花瓣反卷，故名“卷丹”，又因花瓣上有紫黑色斑纹，很象虎背之花纹，故有虎皮百合之雅称；6、美丽百合(鹿子百合)：株高60～100cm，叶对生，宽而疏，故名大叶百合；茎上部开花数朵，花瓣向外反卷，雄蕊露出花瓣之外，花白色和淡红色，花瓣上布有玫瑰色花纹和斑点，状如鹿身上的斑纹，故有鹿子百合之美名；
无论是作为盆花或切花，百合的销售量在国际花卉市场上都名列前茅；有些百合品种的花茎较高，适于作切花；百合球茎含丰富淀粉质，部分品种可作为蔬菜食用，部分还用于保健食品和常用中药中；不少百合都是食用佳品，如我国的兰州百合个大、味甜，既可作点心，又可作菜肴；宜兴的卷丹制成百合汤是夏日消暑佳品；百合还可制作成百合干、百合粉，在国际市场上价格很高；到目前为止，百合还是中药中的常用药材，经济价值巨大；
当前不同百合种间存在血缘差别，所以在种间杂交过程中存在杂交障碍；杂交障碍分为受精前障碍和受精后障碍；受精前障碍，例如花粉粒不萌发、花粉管在柱头或花柱中不伸长，花粉管进入不了子房，进入子房的花粉管不发生向胚珠的定向生长等；受精后障碍，是指由双亲孢子体不协调或配子体不协调，致使受精后的胚中途败育；或者由于胚乳提前败育，不能给胚提供继续发育的营养，最后胚不能发育成苗；受以上杂交障碍影响，种间杂交后的百合组合，获得f1代种苗的几率非常低，导致百合育种效率低下，以致种间杂交产生的新品种非常少；
技术实现要素：
由于百合种间存在不同差别，分为亚洲百合、东方百合与麝香百合；由于亲本的血统组成有差别，不同种间存在杂交障碍；
切花柱法，解决了受精前花粉管在柱头或花柱中不伸的情况，使花粉识别柱头，并且直接向下生长发育，为受精做好充足准备，大大增加了百合杂交的成功率；离体胚抢救的方法，解决了受精后胚乳提前败育，即不能给胚提供继续发育的营养以致不能发育成苗的情况；离体胚抢救，提供了胚正常生长发育所需的营养，降低了由于缺少营养败育的机率；本方法克服了不同百合种间杂交障碍，为培育新颖种间杂交品种提供基础；
为实现克服不同百合种间杂交育种受精前障碍和受精后障碍，提高杂交育种成功率，本发明的技术方案中，切花柱法解决了花粉识别百合花柱头的受精前障碍；离体胚抢救方法为不能提供营养的胚提供充足营养，以保证其正常发育，从而解决了百合受精后的障碍，全过程的提高了百合种间的杂交成功率；
本发明的具体步骤为：
1、花粉前期处理：用小刀和镊子，将成熟花粉剥下，放入事先裁好的草图纸内，折好后放入装有氯化钙粉末的瓶中进行干燥，选取处理好的新鲜花粉进行杂交；
2、人工自交授粉：取将要开放的百合，拨开花瓣，去除未成熟的花药，将百合花朵用杂交袋罩好，使去掉花药的百合花朵完全隔离外界花粉；去掉花药后，当花柱上产生明显柱头分泌物时，将处理好的花粉均匀、大量的涂抹在花柱上，使花粉覆盖柱头面积不少于柱头总面积的2/3；并将花朵罩上杂交袋，在袋外用标签系好并标注百合品种名称及人工自交的日期；
3、切花柱和嫁接花柱：在人工自交授粉1～2天后，以45度角切下人工自交授粉百合花柱总体长度的1/3，同时将要嫁接的母本百合花柱也以45度角切下总体长度的1/3；将切下的人工自交授粉的百合花柱嫁接到剩余2/3的母本的花柱上；关键要使双方的花柱壁对齐，如果不能两边对齐，就保持一侧花柱壁对齐；再用宽1cm、长8-10cm的塑料条将接口捆扎起来，捆扎时要将伤口全部包严，并捆紧；在温室中培养，白天控温在24-26℃，夜间控温在20-22℃；相对湿度85～95％，不通风全遮光，5～6天后受精过程完成，按照常规田间种植方法管理；
4、种子的处理：待果实成熟后，取饱满果实，在相对无菌的环境下按果实腹缝线与背缝线，用解剖刀将其划开；取出合子胚，在光线较好的地点仔细观察胚，选取有胚的种子；将有胚的种子，放入超净工作台中，使用蒸馏水洗净种子，然后采用0.1～0.2％hgcl，消毒20～30s，无菌水冲洗3～4次；
5、切种子接种法：在超净工作台中，沿着种子的直边一侧(非弧形边)，在不切到胚的情况下，用解剖刀切掉0.4～0.5mm边条，含有胚珠部分平躺着接种在ms+6-ba(1～2mg/l)+naa(0.5～1mg/l)、蔗糖30～40g/l、琼脂6～7g/l的ms培养基中进行胚抢救，培养基ph值调到5.8～6.4的范围内，在培养环境温度为20～30℃，光照强度为2000～3000lx,光照时间7～8个小时的培养间进行培养；调节ph值的试剂为：1mol/l磷酸，1mol/l氢氧化钠，以下调节ph值是均与此相同；
6、继代培养：在超净工作台中，将长出叶片的百合材料在超净工作台上进行切割，取大小合适的叶子放到含有0.2～0.6mg/lkt、0.5～1.5mg/l2，4-d、蔗糖30～40g/l、琼脂6～7g/l的ms培养基中进行继代培养，45～55天继代一次，共继代2～3次，培养基为ph值5.8～6.4，在培养环境温度在20～30℃，光照强度为2000～3000lx,光照时间7～8个小时的培养间进行培养；
7、诱导生根培养：在超净工作台中，将继代培养后并长出叶子的百合材料接种到含有1～2mg/lnaa、0.4～0.75mg/lba、蔗糖30～40g/l、琼脂6～7g/l的ms的生根培养基上，培养基为ph值5.8～6.4，在培养环境温度在20～30℃，光照强度为2000～3000lx,光照时间7～8个小时的培养间进行培养，培养25～35天出根；
8、营养生长培养：在超净工作台中，将诱导生根的百合幼苗移植到0.2～0.4mg/lnaa、1～2mg/lba、蔗糖40～60g/l、琼脂6～7g/l的ms营养生长培养基中，培养基ph值为5.8～6.4，在培养环境温度在20～30℃，光照强度为2000～3000lx,光照时间7～8个小时的培养间进行培养，培养25～30天，选取根叶长势良好的百合幼苗出瓶培养；
9、出瓶移栽：将长势良好的百合种苗移栽至按照35～45％腐殖细土、10～20％珍珠岩、10～15％细沙、10～20％草炭和20～25％棉籽壳配比的基质中进行培养，以上基质121℃灭菌40～50分钟，移栽前将株上的琼脂及杂物冲洗干净；30天浇一次营养液，营养液配比为硫酸镁500mg/l、硫酸二氢钾250mg/l、硝酸钾200mg/l、硝酸钙500mg/l、硫酸钾100mg/l、硼酸2mg/l、钼酸铵0.02mg/l、硫酸锌0.2mg/l，其余按照常规田间种植方法管理；
本发明一种克服百合种间杂交障碍的杂交方法，解决百合种间杂交过程中的受精前和受精后障碍，且方法简单有效；本发明方法主要通过采用切柱头嫁接，解决花粉不识别其他柱头的问题，和离体胚抢救的技术使用人工培养基代替胚乳，为胚发育至成苗提供营养，解决了胚败育的问题；本发明克服了百合种间杂交障碍，大大改善了百合种间杂交获得杂交苗成功率低下的问题，提高了百合育种效率，本方法工作强度和成本较低，为大量获得新颖的种间杂交百合新品种打下了坚实的基础；
实施例1
选取优良品种的麝香百合与东方百合育种杂交
1、花粉前期处理：用小刀和镊子，将成熟的麝香百合花粉剥下，放入事先裁好的草图纸内，折好后放入装有氯化钙粉末的瓶中进行干燥，选取处理好的新鲜花粉进行杂交；
2、人工自交授粉：取将要开放的麝香百合，拨开花瓣，去除未成熟的花药，将麝香百合花朵用杂交袋罩好，使去掉花药的麝香百合花朵完全隔离外界花粉；去掉花药后，当花柱上产生明显柱头分泌物时，将处理好的麝香百合花粉均匀、大量的涂抹在花柱上，使花粉覆盖柱头面积不少于柱头总面积的2/3；并将花朵罩上杂交袋，在袋外用标签系好并标注百合品种名称及人工自交的日期；
3、切花柱和嫁接花柱：在人工自交授粉1天后，以45度角切下人工自交授粉的麝香百合花柱总体长度的1/3，同时将要嫁接的母本东方百合花柱也以45度角切下总体长度的1/3；将切下的人工自交授粉的麝香百合花柱嫁接到剩余2/3的东方百合母本的花柱上；关键要使双方的花柱壁对齐，如果不能两边对齐，就保持一侧花柱壁对齐；再用宽1cm、长10cm的塑料条将接口捆扎起来，捆扎时要将伤口全部包严，并捆紧；在温室中培养，白天控温在24℃，夜间控温在22℃；相对湿度90％，不通风全遮光，6天后受精过程完成，按照常规田间种植方法管理；
4、种子的处理：待果实成熟后，取饱满果实，在相对无菌的环境下按果实腹缝线与背缝线，用解剖刀将其划开；取出合子胚，在光线较好的地点仔细观察胚，选取有胚的种子；将有胚的种子，放入超净工作台中，使用蒸馏水洗净种子，然后采用0.1％hgcl，消毒25s，无菌水冲洗4次；
5、切种子接种法：在超净工作台中，沿着种子的直边一侧(非弧形边)，在不切到胚的情况下，用解剖刀切掉0.4mm边条，含有胚珠部分平躺着接种在ms+6-ba(1mg/l)+naa(0.5mg/l)、蔗糖30g/l、琼脂6g/l的ms培养基中进行胚抢救，培养基ph值调到6.4的范围内，在培养环境温度为25℃，光照强度为2500lx,光照时间7个小时的培养间进行培养；调节ph值的试剂为：1mol/l磷酸，1mol/l氢氧化钠，以下调节ph值是均与此相同；
6、继代培养：在超净工作台中，将长出叶片的百合材料在超净工作台上进行切割，取大小合适的叶子放到含有0.3mg/lkt、1mg/l2，4-d、蔗糖30g/l、琼脂6g/l的ms培养基中进行继代培养，50天继代一次，共继代3次，培养基为ph值6.4，在培养环境温度在25℃，光照强度为2500lx,光照时间7个小时的培养间进行培养；
7、诱导生根培养：在超净工作台中，将继代培养后并长出叶子的百合材料接种到含有2mg/lnaa、0.5mg/lba、蔗糖30g/l、琼脂6g/l的ms的生根培养基上，培养基为ph值6.4，在培养环境温度在25℃，光照强度为2500lx,光照时间8个小时的培养间进行培养，培养30天出根；
8、营养生长培养：在超净工作台中，将诱导生根的百合幼苗移植到0.2mg/lnaa、2mg/lba、蔗糖30g/l、琼脂6g/l的ms营养生长培养基中，培养基ph值为6.2，在培养环境温度在25℃，光照强度为2500lx,光照时间8个小时的培养间进行培养，培养30天，选取根叶长势良好的百合幼苗出瓶培养；
9、出瓶移栽：将长势良好的百合种苗移栽至按照40％腐殖细土、20％珍珠岩、10细沙、10％草炭和20％棉籽壳配比的基质中进行培养，以上基质121℃灭菌40分钟，移栽前将株上的琼脂及杂物冲洗干净；30天浇一次营养液，营养液配比为硫酸镁500mg/l、硫酸二氢钾250mg/l、硝酸钾200mg/l、硝酸钙500mg/l、硫酸钾100mg/l、硼酸2mg/l、钼酸铵0.02mg/l、硫酸锌0.2mg/l，其余按照常规田间种植方法管理；
实施例2
选取优良品种的亚洲百合与麝香百合育种杂交
1、花粉前期处理：用小刀和镊子，将成熟的亚洲百合花粉剥下，放入事先裁好的草图纸内，折好后放入装有氯化钙粉末的瓶中进行干燥，选取处理好的新鲜花粉进行杂交；
2、人工自交授粉：取将要开放的亚洲百合，拨开花瓣，去除未成熟的花药，将亚洲百合花朵用杂交袋罩好，使去掉花药的亚洲百合花朵完全隔离外界花粉；去掉花药后，当花柱上产生明显柱头分泌物时，将处理好的亚洲百合花粉均匀、大量的涂抹在花柱上，使花粉覆盖柱头面积不少于柱头总面积的2/3；并将花朵罩上杂交袋，在袋外用标签系好并标注百合品种名称及人工自交的日期；
3、切花柱和嫁接花柱：在人工自交授粉2天后，以45度角切下人工自交授粉的亚洲百合花柱总体长度的1/3，同时将要嫁接的母本麝香百合花柱也以45度角切下总体长度的1/3；将切下的人工自交授粉的亚洲百合花柱嫁接到剩余2/3的麝香百合母本的花柱上；关键要使双方的花柱壁对齐，如果不能两边对齐，就保持一侧花柱壁对齐；再用宽1cm、长8cm的塑料条将接口捆扎起来，捆扎时要将伤口全部包严，并捆紧；在温室中培养，白天控温在26℃，夜间控温在21℃；相对湿度88％，不通风全遮光，5天后受精过程完成，按照常规田间种植方法管理；
4、种子的处理：待果实成熟后，取饱满果实，在相对无菌的环境下按果实腹缝线与背缝线，用解剖刀将其划开；取出合子胚，在光线较好的地点仔细观察胚，选取有胚的种子；将有胚的种子，放入超净工作台中，使用蒸馏水洗净种子，然后采用0.2％hgcl，消毒20s，无菌水冲洗4次；
5、切种子接种法：在超净工作台中，沿着种子的直边一侧(非弧形边)，在不切到胚的情况下，用解剖刀切掉0.5mm边条，含有胚珠部分平躺着接种在ms+6-ba(1.5mg/l)+naa(0.6mg/l)、蔗糖40g/l、琼脂7g/l的ms培养基中进行胚抢救，培养基ph值调到6.2的范围内，在培养环境温度为26℃，光照强度为2800lx,光照时间8个小时的培养间进行培养；调节ph值的试剂为：1mol/l磷酸，1mol/l氢氧化钠，以下调节ph值是均与此相同；
6、继代培养：在超净工作台中，将长出叶片的百合材料在超净工作台上进行切割，取大小合适的叶子放到含有0.4mg/lkt、0.75mg/l2，4-d、蔗糖40g/l、琼脂7g/l的ms培养基中进行继代培养，45天继代一次，共继代2次，培养基为ph值6.2，在培养环境温度在26℃，光照强度为2800lx,光照时间7个小时的培养间进行培养；
7、诱导生根培养：在超净工作台中，将继代培养后并长出叶子的百合材料接种到含有1mg/lnaa、0.5mg/lba、蔗糖40g/l、琼脂7g/l的ms的生根培养基上，培养基为ph值6.2，在培养环境温度在26℃，光照强度为2800lx,光照时间7个小时的培养间进行培养，培养28天出根；
8、营养生长培养：在超净工作台中，将诱导生根的百合幼苗移植到0.2mg/lnaa、1mg/lba、蔗糖50g/l、琼脂7g/l的ms营养生长培养基中，培养基ph值为6.2，在培养环境温度在26℃，光照强度为2800lx,光照时间7个小时的培养间进行培养，培养26天，选取根叶长势良好的百合幼苗出瓶培养；
9、出瓶移栽：将长势良好的百合种苗移栽至按照35腐殖细土、10％珍珠岩、15％细沙、15％草炭和25％棉籽壳配比的基质中进行培养，以上基质121℃灭菌45分钟，移栽前将株上的琼脂及杂物冲洗干净；30天浇一次营养液，营养液配比为硫酸镁500mg/l、硫酸二氢钾250mg/l、硝酸钾200mg/l、硝酸钙500mg/l、硫酸钾100mg/l、硼酸2mg/l、钼酸铵0.02mg/l、硫酸锌0.2mg/l，其余按照常规田间种植方法管理；
实施例3
选取优良品种的东方百合与亚洲百合育种杂交
1、花粉前期处理：用小刀和镊子，将成熟的东方百合花粉剥下，放入事先裁好的草图纸内，折好后放入装有氯化钙粉末的瓶中进行干燥，选取处理好的新鲜花粉进行杂交；
2、人工自交授粉：取将要开放的东方百合，拨开花瓣，去除未成熟的花药，将东方百合花朵用杂交袋罩好，使去掉花药的东方百合花朵完全隔离外界花粉；去掉花药后，当花柱上产生明显柱头分泌物时，将处理好的东方百合花粉均匀、大量的涂抹在花柱上，使花粉覆盖柱头面积不少于柱头总面积的2/3；并将花朵罩上杂交袋，在袋外用标签系好并标注百合品种名称及人工自交的日期；
3、切花柱和嫁接花柱：在人工自交授粉2天后，以45度角切下人工自交授粉的东方百合花柱总体长度的1/3，同时将要嫁接的母本亚洲百合花柱也以45度角切下总体长度的1/3；将切下的人工自交授粉的东方百合花柱嫁接到剩余2/3的亚洲百合母本的花柱上；关键要使双方的花柱壁对齐，如果不能两边对齐，就保持一侧花柱壁对齐；再用宽1cm、长10cm的塑料条将接口捆扎起来，捆扎时要将伤口全部包严，并捆紧；在温室中培养，白天控温在25℃，夜间控温在20℃；相对湿度85％，不通风全遮光6天后受精过程完成，按照常规田间种植方法管理；
4、种子的处理：待果实成熟后，取饱满果实，在相对无菌的环境下按果实腹缝线与背缝线，用解剖刀将其划开；取出合子胚，在光线较好的地点仔细观察胚，选取有胚的种子；将有胚的种子，放入超净工作台中，使用蒸馏水洗净种子，然后采用0.2％hgcl，消毒20s，无菌水冲洗4次；
5、切种子接种法：在超净工作台中，沿着种子的直边一侧(非弧形边)，在不切到胚的情况下，用解剖刀切掉0.4mm边条，含有胚珠部分平躺着接种在ms+6-ba(2mg/l)+naa(1mg/l)、蔗糖35g/l、琼脂7g/l的ms培养基中进行胚抢救，培养基ph值调到6.0的范围内，在培养环境温度为26℃，光照强度为2700lx,光照时间8个小时的培养间进行培养；调节ph值的试剂为：1mol/l磷酸，1mol/l氢氧化钠，以下调节ph值是均与此相同；
6、继代培养：在超净工作台中，将长出叶片的百合材料在超净工作台上进行切割，取大小合适的叶子放到含有0.4mg/lkt、0.5mg/l2，4-d、蔗糖35g/l、琼脂7g/l的ms培养基中进行继代培养，50天继代一次，共继代3次，培养基为ph值6，在培养环境温度在25℃，光照强度为3000lx,光照时间8个小时的培养间进行培养；
7、诱导生根培养：在超净工作台中，将继代培养后并长出叶子的百合材料接种到含2mg/lnaa、0.5mg/lba、蔗糖35g/l、琼脂7g/l的ms的生根培养基上，培养基为ph值6，在培养环境温度在25℃，光照强度为3000lx,光照时间8个小时的培养间进行培养，培养25天出根；8、营养生长培养：在超净工作台中，将诱导生根的百合幼苗移植到0.4mg/lnaa、2mg/lba、蔗糖60g/l、琼脂7g/l的ms营养生长培养基中，培养基ph值为6，在培养环境温度在25℃，光照强度为3000lx,光照时间8个小时的培养间进行培养，培养27天，选取根叶长势良好的百合幼苗出瓶培养；
9、出瓶移栽：将长势良好的百合种苗移栽至按照45％腐殖细土、10％珍珠岩、15％细沙、10％草炭和20％棉籽壳配比的基质中进行培养，以上基质121℃灭菌50分钟，移栽前将株上的琼脂及杂物冲洗干净；30天浇一次营养液，营养液配比为硫酸镁500mg/l、硫酸二氢钾250mg/l、硝酸钾200mg/l、硝酸钙500mg/l、硫酸钾100mg/l、硼酸2mg/l、钼酸铵0.02mg/l、硫酸锌0.2mg/l，其余按照常规田间种植方法管理。