技术领域本发明涉及一种杀线虫剂及其制备方法，具体涉及一种庆大霉素1-癸醇混配杀线虫剂及其制备方法，属于生物农药领域。
背景技术：
松材线虫病（bursaphelenchusxylophilusnickle）是一种导致松树大量枯死的特大毁灭性传染性病害，被称为松树的“癌症”，引起了国内外普遍重视，成为检疫对象。自1982年在南京中山陵首次发现松材线虫以来，对我国森林资源特别是南方广泛种植的的松树造成了严重威胁，已扩散至14省市，致死几亿多株松树，毁林30多万hm2，损失上千亿元。具有分布广泛，蔓延快，造成经济损失严重的特点。目前福建等高发病区已经被列为疫区，为保护松树健康，应该重视松材线虫的发生和防治。
对松材线虫（bursaphelenchusxylophilus）的防治在病情监测、病株监测、病株清除等防治策略上，相比化学药剂防治，更多提倡采用较为环保安全的生物防治。松材线虫生物防治主要有两个方面：一是直接对线虫进行防治，还有一种是对松材线虫的主要传播媒介昆虫松墨天牛(monochamusalternatus)进行防治，有关松墨天牛的生物防治研究和利用的报道相对较多。对松材线虫病实行生物防治，对环境和人类友好，具有广阔的发展前景。
放线菌（actinomycete)是一种具有丰富资源的微生物类群，是发现新型抗生素的重要资源，在生物防治中很有开发应用前景。尽管生物农药在一定时期内还不能取代化学农药，但随着化学农药弊端的出现，化学农药的使用表现出一定的局限性。随着现代生物技术的出现，尤其是基因工程技术的高度发展，为彻底改造野生型放线菌进而筛选到有活性的菌株提供了有利的工具。放线菌将成为一类有着广泛实际应用价值的微生物资源，在植物病、虫、草害的生物防治中很有开发应用前景。放线菌产生的次生代谢产物具有丰富的结构多样性，利用其次生代谢产物抗生素制备的新农药，已成为无公害农药的主体和未来农药的发展方向。目前放线菌特别是稀有放线菌小单孢菌应用于林业线虫例如松材线虫等防治上有待进一步加强研究。
在活性微生物次级代谢产物具有活性的基础上，加入稳定化学物质，改变微生物生长情况，可改变其次级代谢产物，能加强杀线杀虫等活性，混配是提高培养基效价的一种可行方法。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种庆大霉素1-癸醇混配杀线虫剂及其制备方法。通过添加庆大霉素、1-癸醇，提高海洋放线菌(micromonosporachalcea)的杀松材线虫活性。
本发明的庆大霉素1-癸醇混配杀线虫剂的制备方法，其特征在于步骤如下：
1、配制海洋放线菌液态发酵培养基：在1000ml的水中加入可溶性淀粉20g、酵母粉5g、k2hpo4·3h2o0.58g、nacl0.81g、mgso4·7h2o0.72g、caco30.28g、feso4·7h2o0.01g、10%的1-癸醇500ul、重量比为0.03%无菌庆大霉素3ml，调ph7.2-7.5；所述10%的1-癸醇，指1-癸醇与水的体积比为10%，并用0.22um的细菌过滤器灭菌；
2、发酵培养：按体积比为6%的接种量，在步骤1的培养基中接种海洋放线菌菌株ex-10-2711，培养温度32℃，转速145rpm，发酵时间96h，获得发酵液；
3、发酵液处理：将步骤2的发酵液分装于无菌50ml大离心管中，离心1-3次，每次5000rpm/min离心10min，分离获得上清和沉淀；a)上清，4℃保存备用；b)沉淀，用无菌水洗涤3次后，将离心洗涤后的细胞团与3倍体积的无菌1%nacl混匀，于560w和工作时间/间隔时间为5s的条件下在超声波破碎仪中冰浴破碎5min，破碎后5000rpm离心10min去沉淀，取上清液4℃保存备用。
4、制备杀线虫剂：合并步骤3二次获得的上清液，即为庆大霉素1-癸醇混配的杀线虫剂。
本发明使用的海洋放线菌菌株ex-10-2711和各种化学原料均由市场购得。
本发明的优点：根据已有研究表明，1-癸醇对松材线虫具有活性，但是，单独使用的效果差，实际操作性不强。本发明将1-癸醇与微生物混合培养，改变微生物生长环境，改变其次级代谢产物，进而增强了其杀线活性，其制剂达到杀松材线虫的效果。
具体实施方式为了充分公开本发明的庆大霉素1-癸醇混配杀线虫剂及其制备方法，以下结合实施例加以说明。
实施例1、一种庆大霉素1-癸醇混配杀线虫剂的制备方法，包括以下步骤：
1、基础培养基组分的获得
设计k2hpo4·3h2o、nacl、mgso4·7h2o、caco3浓度梯度，为6因素8水平，以上清液死亡率为响应值，采用86均匀设计方案得到基础培养基，均匀设计实验方案（86）及其结果如表1所示。
表1均匀设计实验方案（86）及其结果
注：因子n1-n8指6个因子设置了8梯度浓度；实验号1-8指8个实验组。
（1）对表1实验数据进行回归分析，建立回归方程为：
回归方程1：
y1=0.1964x1+0.1749x2+5.7000x3+9.6908x4+8.4374x5+1.8023x6-1.0757
其中：y1指上清液活性；x1-x6分别指6个实验因子碳源、氮源、k2hpo4、nacl、mgso4、caco3；
通过回归回归方程显著性分析可知，x1、x2不显著，删除x1、x2重新得到回归方程2：
y2=5.7612x3+8.0817x4+7.2081x5+2.7513x6-0.3461
其中，y2指删除x1、x2后的上清液活性；
（2）通过以上分析，各个因素对活性影响的主次顺序为：x4(nacl)>x5(mgso4)>x3(k2hp04)>x6（caco3）
根据回归方程和实际经验得出较佳的工艺条件为：可溶性淀粉（20g）+酵母粉（5g）+k2hpo4·3h2o（0.58g）+nacl（0.81g）+mgso4·7h2o（0.72g）+caco3（0.28g）+feso4·7h2o（0.01g）+自来水（1000ml），ph7.2-7.5。
2、制备海洋放线菌液态发酵培养基：
取可溶性淀粉（20g）+酵母粉（5g）+k2hpo4·3h2o（0.58g）+nacl（0.81g）+mgso4·7h2o（0.72g）+caco3（0.28g）+feso4·7h2o（0.01g）+体积比为10%的1-癸醇（500ul）+重量比为0.03%无菌庆大霉素3ml+自来水（1000ml），ph7.2-7.5。
所述10%1-癸醇配制：取100ul至1.5mlep管中，加入900ul无水乙醇混匀，用0.22um的细菌过滤器灭菌，4℃保存备用。
3、发酵培养：在海洋放线菌液态发酵培养基中接种海洋放线菌菌株ex-10-2711，海洋放线菌菌株ex-10-2711的接种量6%（v/v），培养温度32℃，转速145rpm，发酵时间96h。
4、发酵液处理：发酵4d后，发酵液用无菌50ml大离心管分装，3次离心，每次5000rpm/min离心10min，分离上清和沉淀。a)上清，4℃保存备用；b)沉淀物用无菌水洗涤3次，后用电子天平称量其湿重，即为生物量，将离心洗涤后的细胞团与3倍体积的无菌1%nacl混匀，于560w和工作时间/间隔时间是5s的条件下在超声波破碎仪中冰浴破碎5min，破碎后5000rpm离心10min去沉淀，取上清液4℃保存备用。
5、合并步骤4两次获得的上清液，即为庆大霉素1-癸醇混配的杀线虫剂。
6、生测及其结果：应用96孔板生测法，采用100ul体系，线虫液浓度100条/100ul，生测体系及其结果如表2所示。
表2生测体系及其结果
本实验设置两个对照组，对照1）：用庆大霉素取代菌，加入相应的培养基中，以验证该菌是否也产庆大霉素；对照2）纯培养基，不加菌也不加庆大霉素，以验证活性作用是否来源于菌产生的活性物。处理组以上清液杀线活性、胞内物质杀线活性和生物量为指标，可以看出，混配后效果优于基础培养基；生物量只是代表菌体生长情况，没有多大差异。
使用方法：本发明的庆大霉素1-癸醇混配的杀线虫剂为液体，使用时，将其稀释100-3000倍后，浇洒于植物根部的土壤上，防治植物线虫。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。