一种利用大花六道木叶片进行离体再生的方法与流程

本发明属于外植体诱导再生领域，具体涉及一种利用大花六道木叶片进行离体再生的方法。

背景技术：

大花六道木(abeliagrandiflora)是忍冬科(caprifoliaceae)六道木属(abelia)植物，是六道木中较早出现的园艺种，为六道木的矮化品种，目前国内已有引进，但数量非常有限。它是原产中国的糯米条(a.chinensis)和单花六道木(a.uniflora)杂交而成，后经国外育种，形成了几种更有特色的园艺品种。

大花六道木生长快，株型非常美丽，枝条柔顺下垂，树姿婆娑，无论是作为园中配植，还是用作绿篱和花径的群植，都非常合适。花期长，每年从初夏至仲秋都是大花六道木的盛花期，开花时节满树白花，玉雕冰琢，晶莹剔透。在阳光照射下微微泛着荧光，衬以粉红的花萼、墨绿的叶片，分外醒目。即使白花凋谢，红色的花萼还可宿存至冬季，极为壮观。大花六道木不但很美，而且适应性非常强。它对土壤要求不高，酸性和中性土都可以；对肥力的要求也不严格，耐干旱、瘠薄，萌蘖力、萌芽力很强盛，同时可反复修剪。华东、西南及华北可露地栽培，是庭院绿化观赏的好树种。

尽管大花六道木的品种繁多，观赏效果极佳，由于大花六道木种子小，不易收获，常用扦插繁殖。但是，该繁殖方法繁殖系数较低，并且费时费力。

目前，国内外对大花六道木组织培养的研究较少，且大多通过诱导顶芽或腋芽生长点直接发生的方式获得无菌苗，并通过无菌短枝扦插的方式实现增殖，此方式增殖系数较低，很难满足种苗生产的需求。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用大花六道木叶片进行离体再生的方法，建立大花六道木直接器官发生的技术，有效提高增殖效率，缩短种苗繁殖周期，此再生方式可用于遗传转化的受体系统，有助于今后的基因改良。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用大花六道木叶片进行离体再生的方法，包括以下步骤：

1)外植体预处理

选取大花六道木叶片作为外植体，外植体清洗后进行消毒，再冲洗，备用；

2)诱导不定芽

将叶片剪切后接种于诱导培养基中，暗培养30～40天，诱导出不定芽；

其中，所述的诱导培养基以改良ms培养基为基本培养基，并含有6-苄基腺嘌呤0.4～0.6mg/l；其中，所述改良ms培养基为nh4no3、kno3、cacl2·2h2o、mgso4·7h2o和kh2po4含量减少的ms培养基；

3)增殖培养

将不定芽转入增殖培养基中，光照培养20～30天，形成丛生芽；

光照培养条件为：温度为25～28℃，光照时间14～16小时，光照强度为2000～3000勒克斯；

其中，所述的增殖培养基以wpm培养基为基本培养基，并添加了6-苄基腺嘌呤0.5～1.0mg/l和萘乙酸0.1～0.2mg/l；

4)生根培养

将丛生芽切分成单株，接入生根培养基中，培养25～30天后生根，得到生根苗；

培养条件为：温度为25～28℃，光照时间14～16小时，光照强度为2000～3000勒克斯；

其中，所述的生根培养基以wpm培养基为基本培养基，并添加了吲哚丁酸0.2～1mg/l和萘乙酸0.5～1.0mg/l；

5)炼苗、驯化

将大花六道木生根苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗2～3天，移栽至基质中，保持温度20～30℃，驯化培养20～30天，得到幼苗。

优选地，步骤2)所述的暗培养温度为25～28℃。

进一步，步骤2)～4)中所述的诱导培养基、增殖培养基和/或生根培养基中分别添加蔗糖20～30g/l和琼脂6～8g/l，培养基ph值为5.6～5.8。

又，步骤2)～4)中所述诱导培养基、增殖培养基和/或生根培养基中添加活性炭0.4～0.8g/l。

进一步，步骤4)所述生根培养基中添加抗坏血酸0.2～0.4g/l。

优选地，步骤5)中所述基质为：草炭土：珍珠岩＝3～4：1，体积比。

优选地，所述改良ms培养基中，nh4no3含量为800～850mg/l，kno3含量为900～1000mg/l，cacl2·2h2o含量为200～240mg/l，mgso4·7h2o含量为170～200mg/l，kh2po4含量为80～90mg/l。

更优选地，所述改良ms培养基中，nh4no3含量为825mg/l，kno3含量为950mg/l，cacl2·2h2o含量为220mg/l，mgso4·7h2o含量为185mg/l，kh2po4含量为85mg/l。

本发明中，ms培养基的配方，由murashiget和skoogf于1962年发表公布(murashigetandskoogf，1962，arevisedmediumforrapidgrowthandbioassayswithtobaccotissuecultures.physiolplant15：473–479)。

本发明所述wpm(woodyplantmedium)培养基配方，由lloyd和mccown于1980发表公布(commerciallyfeasiblemicropropagationofmountainlaurel,kalmialatifolia，byuseofshoot-tipculture.procintplantpropsoc30：420–427)。

本发明中，采用大花六道木的叶片进行组织培养，叶片数量多，外植体取材容易，在诱导培养过程中，添加了6-ba，使叶片不经过愈伤组织，直接诱导发生不定芽，在此过程中，若6-ba含量过高，则会使愈伤组织增多，难以得到不定芽，若含量太低，则又起不到促进诱导的作用，因此，本发明控制6-ba含量在0.4～0.6mg/l，诱导不定芽的发生，同时，采用ms大量元素减少的方案，可防止外植体受到毒害，提高诱导率。

本发明在增殖培养基和生根培养基中添加活性炭可提高增殖系数，防止愈伤组织生成并促进生根，在生根培养基中添加抗坏血酸可防止茎基部褐化，促进生根。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

本发明利用大花六道木的叶片直接诱导不定芽发生，进行植株的再生，有效提高增殖效率，缩短种苗的繁殖周期至两个月，并且，此再生方式可用于遗传转化的受体系统，有助于进行基因改良。

本发明利用叶片直接诱导不定芽发生，诱导系数在6以上，增殖系数得到了很大的提高，增殖系数在5以上，可显著降低大花六道木的种苗生产成本。

附图说明

图1为本发明实施例1中进行诱导培养的外植体。

图2为本发明实施例1中诱导出的不定芽。

图3为本发明实施例1中得到的丛生芽。

图4为本发明实施例1中大花六道木品种“mardigras”的生根苗。

图5为本发明实施例1中驯化后的幼苗。

图6为本发明实施例2中大花六道木品种“twistoflime”的丛生芽。

图7为本发明实施例2中大花六道木品种“twistoflime”的生根苗。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1一种大花六道木品种“mardigras”的叶片进行离体再生的方法，培养步骤如下：

1)外植体的选取：外植体来自上海市农业科学院奉浦园区苗圃中种植的大花六道木“mardigras”品种植株的叶片。

2)外植体的消毒：取作为外植体的叶片，用软细毛刷蘸洗洁精清洗干净后，再流水冲洗1～2个小时，在超净台上用70％的酒精消毒30秒，0.1％hgcl2消毒10分钟，最后无菌水冲洗5次，备用。

3)不定芽诱导：将消毒后的叶片，剪掉叶尖和叶片两侧，剪成0.5×0.5cm叶片方块，参见图1，将叶背朝下接种于不定芽诱导培养基中，在25℃黑暗培养30天可诱导出不定芽，参见图2，平均每个叶片方块能诱导出12个不定芽。

所述不定芽诱导培养基以改良ms培养基为基本培养基，添加6-苄基腺嘌呤(6-ba)0.4mg/l、蔗糖30g/l和琼脂7g/l，培养基ph值为5.7～5.8。

4)不定芽增殖培养：将黑暗中诱导的不定芽转入光照下培养，培养温度为25℃，光周期16/8小时，光照强度为2000～3000勒克斯，约25天后得到丛生芽，参见图3，丛生芽的平均增殖系数为5.8。

所述增殖培养基中以wpm培养基为基本培养基，添加6-苄基腺嘌呤1.0mg/l、萘乙酸(naa)0.1mg/l、蔗糖20g/l，琼脂7g/l，培养基ph值为5.6～5.8。

5)丛生芽生根培养：将诱导出的丛生芽切下接入生根培养基中，培养30天后生根，参见图4，生根率达到70％以上。

其中，所述生根培养基中含有wpm培养基、吲哚丁酸(iba)0.2mg/l、萘乙酸0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6-8g/l，培养基ph值为5.7～5.8。培养温度为25℃，光周期16/8小时，光照强度为2000～3000勒克斯。

6)组培苗炼苗和移栽：将生根的大花六道木幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗2天后，取出幼苗，洗去根上的培养基，移栽在装有草炭土和珍珠岩(4：1)的穴盘中，保持温度20～30℃，在遮光率为50％左右的阴棚内培育，并早晚各喷水一次保持湿度，20天后得到驯化好的幼苗，参见图5。

本实施例中，大花六道木植株的再生周期大约需要105天。

实施例2一种大花六道木品种“twistoflime”的叶片进行离体再生的方法，培养步骤如下：

1)外植体的选取：外植体来自上海市农业科学院奉浦园区苗圃中种植的大花六道木“twistoflime”品种植株的叶片。

2)外植体的消毒：取作为外植体的叶片，用软细毛刷蘸洗洁精清洗干净后，流水下冲洗1～2个小时，在超净台上用70％的酒精消毒60秒，0.2％hgcl2消毒6分钟，最后无菌水冲洗5次，备用。

3)不定芽诱导：将消毒后的叶片，剪掉叶尖和叶片两侧，剪成0.5×0.5cm叶片方块，将叶背朝下接种于不定芽诱导培养基中，在25℃黑暗培养40天可诱导出不定芽，平均每个叶片方块能诱导出6个不定芽。

所述不定芽诱导培养基以改良ms培养基为基本培养基，添加6-苄基腺嘌呤0.6mg/l、蔗糖30g/l和琼脂7g/l，培养基ph值为5.6～5.8。

4)不定芽增殖培养：将黑暗中诱导的不定芽转入光照下，培养温度为25℃，光周期16/8小时，光照强度为2000～3000勒克斯，约30天后形成不丛生芽，丛生芽的平均增殖系数为5.1。

所述增殖培养基以wpm培养基为基本培养基，添加6-苄基腺嘌呤0.5mg/l、萘乙酸0.2mg/l、蔗糖25g/l，琼脂7g/l，培养基ph值为5.6～5.8。

5)丛生芽生根培养：将诱导出的丛生芽切下，接入生根培养基中，培养温度为25℃，光周期16/8小时，光照强度为2000～3000勒克斯，培养30天后得到生根苗，参见图2，生根率在75％以上。

所述生根培养基以wpm培养基为基本培养基，添加吲哚丁酸(iba)0.5mg/l、萘乙酸(naa)1.0mg/l、蔗糖20g/l、琼脂6g/l和活性炭0.4g/l，培养30天后生根，培养基ph值为5.6～5.8。

6)组培苗炼苗和移栽：将生根的大花六道木幼苗的培养基瓶盖打开，室温下炼苗2天后，取出幼苗，洗去根上的培养基，移栽在装有草炭土和珍珠岩(4：1)的穴盘中，保持温度20～26℃，保持温度20～30℃，在遮光率为50％左右的阴棚内培育，并早晚各喷水一次保持湿度，20天后得到驯化好的幼苗。

本实施例中，完成大花六道木品种“twistoflime”的植株再生周期大约需要120天。

实施例1和2中所述改良ms培养基配方如表1所示，mg/l表示每升改良ms培养基中含各成分的毫克数。

表1

实施例1和2中wpm培养基配方如表2所示，mg/l表示每升wpm培养基中含各成分的毫克数。

表2

实施例3～4和对比例

实施例3和4中，除生根培养基配方不同外，其余培养方法参照本发明实施例2，设对比例1～2，培养基配方及对比结果参见表3。

表3

由表3可见，生长素浓度是影响大花六道木生根的重要因素，没有添加任何生长素的培养基(对比例1)或生长素浓度较低时(对比例2)，大花六道木的生根率较低，难以满足生产需求。

本发明将两种生长素iba和naa配合使用，可以有效提高大花六道木的生根率，当生长素的浓度继续加大时，生根率没有显著增加。因此，合适的iba和naa浓度配比，才能实现大花六道木的生根率最大化。