一种马尾松菌根化苗木的培育方法与流程

本发明属于马尾松菌根化苗木的培育领域，具体地说，涉及一种马尾松菌根化苗木的培育方法。

背景技术：

外生菌根(Ectomycorrhizae，ECM)是林木最重要的菌根类型，是外生菌根真菌(Ectomycorrhizae Fungi，ECMF)与植物营养根的共生体。在这个共生体中，ECMF吸收养分和水分供寄主所需，同时植物供给ECMF必要的碳水化合物及其他营养物质，二者相互依存并高度统一。全球大约有97％的植物是菌根植物，其中乔木占绝大多数，如松科(Pinaceae)、柏科(Cupressaceae)、杨柳科(Salicaceae)、桦木科(Betulacele)、壳斗科(Fagaceae)等34科百余属植物，且这些树种多为重要用材树种。因此，外生菌根在改善植物营养的同时对森林生态系统也产生了很大的的影响。早在上世纪50年代，Harley等(Harley J.L,McCready C.C.Uptake of phosphate by excised mycorrhizal roots of beech[J].New Phytol,1950,49:388.)就发现菌根苗对磷的吸收能力要比非菌根苗强2.3-8.9倍，之后越来越多的研究发现有些菌根真菌能促进寄主对磷的吸收和利用(Hodge A.The plastic plant:root responses to heterogeneous supplies of nutrients[J].New Phytologist,2004,162:9-24.)。Soleimanzadel(Soleimanzadeh.H.Response of Sunflower(Helianthus annuus L.)To Inoculation with Mycorrhiza Under Different Phosphorus Levels[J].American-Eurasian J.Agric.&Environ.Sci.,2012,12(3):337-341.)认为，菌根可以替代化学磷肥而用于有机农业，而苗床接种ECMF可以提高种苗质量，提高造林成活率。

马尾松(Pinus massoniana Lamb.)，属裸子植物，乔木，松科松属。是我国西南地区林地主要的造林树种。主要采用大田育苗方式，但是由于土传病害严重导致该方式育苗成活率低，生长缓慢。而造林用苗数量很大，且当前育苗技术环节薄弱，因此提高马尾松幼苗的产量和质量乃是育苗工作的当务之急。如在马尾松苗期接入有效的外生菌根真菌(ectomycorrhizal fungi，ECMF)，可以方便、经济、有效地促进苗木对磷等养分的吸收和利用，促进苗木生长，提高抗逆性，继而提高人工造林成活率。目前，菌根化技术已被美国、法国、加拿大、澳大利亚、挪威等国列为广泛推行的现代林业生物技术。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明针对上述的问题，提供了一种马尾松菌根化苗木的培育方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种马尾松菌根化苗木的培育方法，包括以下步骤：

步骤1、种子处理：挑选无病虫害、颗粒饱满均匀的马尾松种子，在质量浓度为25％-35％的双氧水中震动25-35min进行表面消毒后，用纯水冲洗干净，置于35-45℃温水中浸泡20-28小时，然后放置到装有珍珠岩的培养皿中进行催芽，待90％以上种子露白后播种；

步骤2、土壤处理：选择马尾松林下酸性冷砂黄壤作为供试土壤，土壤经2％的甲醛溶液消毒杀菌，膜覆盖7d，揭膜翻晒晾干，7d后备用；

步骤3、制备外生菌根真菌菌根菌剂；

步骤4、外生菌根真菌菌根菌剂接种：播种前将苗床细作整平后，铺15cm厚的经2％甲醛消毒且过筛的马尾松林下土；将接种体与经2％甲醛消毒的土混合成糊状，然后与经过催芽的马尾松种子拌匀，撒入苗床土壤中，每平方米撒播200粒马尾松种子；播种后再在其表面覆一层细土，以不见种子为宜；然后苗床洒透水；

步骤5、苗期管理：苗期管理参照GB6001-1985《育苗技术规程》执行；

步骤6、苗木出圃，培育出马尾松菌根化苗木。

进一步地，步骤2中供试土壤的基本理化性质如下：全量养分中N的含量为1.14g/kg，P的含量为0.16g/kg，K的含量为19.09g/kg；有效养分中N的含量为69.75mg/kg，P的含量为4.55mg/kg，K的含量为71.21mg/kg；交换性盐中Ca的含量为3.45cmol/kg，Mg的含量为0.34cmol/kg，K的含量为0.14cmol/kg。

进一步地，步骤3中的制备外生菌根真菌菌根菌剂具体如下：

步骤3.1、外生菌根真菌的分离和培养：选取新鲜、幼嫩、未开伞、无病虫害的完整子实体，用75％的酒精棉球表面消毒，待表面酒精挥发后，将子实体菌柄菌盖联结处掰开，用酒精和火焰消毒过的解剖刀在掰开的子实体内部取0.2cm-0.3cm大小的菌块，接在PDA平板上；将平板放入人工气候箱中25℃培养；3天后检查是否有污染，根据外生菌根真菌菌丝体是否直接从接种块上长出、生长速度以及同种真菌形成的菌落形态特征一致等特点，初步判定所分离菌种是否为外生菌根真菌纯培养物，对其生长特征进行详细观察；筛选无污染、菌落形态特征良好的各分离菌种进一步在PDA培养基上进行转接纯化，每7d一次，直至其生长稳定；4℃下保藏备用；

步骤3.2、将步骤3.1中分离纯化的外生菌根菌种转接到Pachlewski固体培养基上，在恒温条件下暗培养2周，作为母菌备用；

步骤3.3、接种体培养：在超净台下，将活化的菌种用打孔法转接到经高温灭菌后的Pachlewski液体培养基上，每瓶接入面积为5mm×5mm的母菌菌块4片，室温下静置培养2周，得菌丝体；培养完成后，将菌丝体在打浆机中低速打散1min，收集菌丝体悬浮液，作为接种体。

进一步地，所述PDA培养基通过以下方法制备得到：将200g马铃薯洗净去皮切碎后加水1000ml煮沸30min，用纱布过滤后再加葡萄糖20g、琼脂20g充分溶解，121℃高温灭菌30min后取出备用。

进一步地，所述Pachlewski固体培养基的配方为：每1L培养基中包括酒石酸铵0.5g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁0.5g、葡萄糖20g、维生素B₁ 0.001g、琼脂20g、微量元素混合液1mL；每升微量元素混合液含H₃BO₃ 8.45mg、MnSO₄ 5mg、FeSO₄ 6mg、CuSO₄ 0.625mg、ZnCl₂2.77mg和(NH4)₂MoO₄ 0.27mg。

进一步地，外生菌根真菌为Pt 715、Ld 2或Ld3菌中的一种。

进一步地，步骤5中苗期管理参照GB6001-1985《育苗技术规程》执行，具体为：

步骤5.1、苗床管理：适时浇水，保持苗床湿润；同时做好排灌设施，保证水能均匀分配到各小区苗床，且试验期间不使用任何杀菌剂；

步骤5.2、各苗期注意事项：

a)种芽期：即播种后到种子吐芽，需要施放鼠药防止鼠害；控制灌溉，苗床保持湿润；

b)芽苗期：即发芽种子出土，但是种壳尚未脱落，注意防鸟害；采取少量多次灌溉措施；

c)条叶期：即幼苗顶端长出条状原生叶，要进行松土、除草；采取多量少次灌溉措施；

步骤5.3、间苗：为了减少水分消耗，促使幼苗茁壮成长，可等各小区幼苗生长稳定，即幼苗出齐一个月后后，将过密细弱的幼苗疏间，同时对过于稀疏的地方进行补栽；每平方米保留苗木140-160株；

步骤5.4、病害防治：马尾松幼苗出土两个月内，由于土壤和空气湿度增加，极易被病菌侵染。期最常见的病害是猝倒病、立枯病；因此在这段时间要勤观察、抓紧防治；一旦发现病情，立即将病苗拔除烧毁，然后用0.5％-1.0％的波尔多液喷洒，每7d一次；

步骤5.5、虫害防治：马尾松毛虫是最严重的马尾松害虫，喜食松针，严重影响松林生长；在育苗期间采用化学防治方法较为方便，即将50％敌敌畏稀释2000倍；或50％杀螟松乳剂稀释1500倍。

进一步地，步骤6中苗木出圃具体为：

步骤6.1、起苗：在春季芽苞尚未萌动之前起苗，起苗之前需要利用铲子进行挖取，保证苗木根系带有宿土，不能直接用手拔，要做到：少伤侧根、须根，保持根系比较完整和不折断苗干，不伤顶芽；然后根部用薄膜进行包装；

步骤6.2、分级：根据综合控制条件、根系、地径和苗高确定苗木是否合格；综合控制条件为：无检疫对象病虫害，苗干通直、色泽正常；将合格苗分为Ⅰ、Ⅱ两个等级；苗木分级在庇荫背风处；

步骤6.3、质量检验：起苗后苗木质量检测要在一个苗批内进行，采取随机抽样的方法进行；游标卡尺测量地径，精确度0.05cm；直尺测量苗高和根系，精确度1cm；

步骤6.4、假植：起苗后如不能及时移植要选择排水良好、背风阴凉的地方进行假植。

步骤6.5、包装：苗木每包重量不超过30kg，每包需贴上标签；

步骤6.6、运输：运输过程要采取保湿、透气措施，防止风吹日晒，长途运输苗木要用稻草或草袋包裹。

进一步地，步骤6.2中的苗木等级划分见下表：

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明接种外生菌根真菌，显著改善了马尾松的生长状况、养分吸收，促进了幼苗的生长，尤其促进了磷素的吸收。

2)本发明中Ld2促生效果最好，可作为后期菌根化育苗的理想菌种，来提高造林质量和林木产量，加快我国森林绿化的步伐。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明马尾松的菌根侵染率；图中不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，下同；

图2是本发明外生菌根真菌对马尾松幼苗磷含量的影响；

图3是本发明外生菌根真菌对马尾松幼苗钾含量的影响；

图4是本发明外生菌根真菌对马尾松幼苗钙含量的影响；

图5是本发明外生菌根真菌对马尾松幼苗镁含量的影响；

图6是本发明外生菌根真菌对马尾松幼苗铁含量的影响。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明公开了一种马尾松菌根化苗木的培育方法，包括以下步骤：

步骤1、种子处理：挑选无病虫害、颗粒饱满均匀的马尾松种子，在质量浓度为25％-35％的双氧水中震动25-35min进行表面消毒后，用纯水冲洗干净，置于35-45℃温水中浸泡20-28小时，然后放置到装有珍珠岩的培养皿中进行催芽，待90％以上种子露白后播种；

步骤2、土壤处理：供试土壤为马尾松林下酸性冷砂黄壤，土壤经2％的甲醛溶液消毒杀菌，膜覆盖7d，揭膜翻晒晾干，7d后备用。供试土壤基本理化性质见表1。

表1土壤的基本理化性质

步骤3、制备外生菌根真菌菌根菌剂：

步骤3.1、外生菌根真菌的分离和培养：

外生菌根真菌为Pt 715、Ld 2或Ld3中的一种；

菌种分离培养采用PDA培养基：将200g马铃薯洗净去皮切碎后加水1000ml煮沸30min，用纱布过滤后再加葡萄糖20g、琼脂20g充分溶解，121℃高温灭菌30min后取出备用。所有分离工作均在超净工作台上完成。选取新鲜、幼嫩、未开伞、无病虫害的完整子实体，用75％的酒精棉球表面消毒，待表面酒精挥发后，将子实体菌柄与菌盖联结处掰开，用酒精和火焰消毒过的解剖刀在掰开的子实体内部取0.2cm-0.3cm大小的菌块，接种在PDA平板上。将平板放入人工气候箱中25℃培养。3天后检查是否有污染，根据外生菌根真菌菌丝体是否直接从接种块上长出、生长速度以及同种真菌形成的菌落形态特征一致等特点，初步判定所分离菌种是否为外生菌根真菌纯培养物，对其生长特征进行详细观察和记录。筛选无污染、菌落形态等特征良好的各分离菌种进一步在PDA培养基上进行转接纯化，每7d一次，直至其生长稳定。4℃下保藏备用。

步骤3.2、母菌培养：将步骤3.1中分离纯化的外生菌根菌种转接到Pachlewski固体培养基上，在恒温条件下暗培养2周，作为母菌备用。Pachlewski固体培养基配方见表2。

表2Pachlewski固体培养基组成

注：每升微量元素混合液含H₃BO₃ 8.45mg、MnSO₄ 5mg、FeSO₄ 6mg、CuSO₄ 0.625mg、ZnCl₂ 2.77mg和(NH4)₂MoO₄ 0.27mg。

步骤3.3、接种体培养：在超净台下，将活化的菌种用打孔法转接到经高温灭菌后的Pachlewski液体培养基上，每瓶接入面积为5mm×5mm的母菌菌块4片，室温下静置培养2周，得菌丝体。培养完成后，将菌丝体在打浆机中低速打散1min，收集菌丝体悬浮液，作为接种体。

步骤4、菌根菌剂接种：于3月份进行育苗，播种前将苗床细作整平后，铺约15cm厚的经2％甲醛消毒且过筛的马尾松林下土，

马尾松接种采用拌种法。将Pt 715、Ld 2、Ld3接种体菌丝打散,与经2％甲醛消毒的土混合成糊状，然后与经过催芽的马尾松种子拌匀，分别撒入相应的苗床土壤中，每平方米撒播约200粒马尾松种子。播种后再在其表面覆一层细土，以不见种子为宜。然后苗床洒透水。

步骤5、苗期管理：菌根化苗木苗期管理参照GB6001-1985《育苗技术规程》执行。

步骤5.1、苗床管理：适时浇水，保持苗床湿润。同时做好排灌设施，保证水能均匀分配到各小区苗床，且试验期间不使用任何杀菌剂。

步骤5.2、各苗期注意事项：

a)种芽期：即播种后到种子吐芽，需要施放鼠药防止鼠害。控制灌溉，苗床保持湿润即可。

b)芽苗期：即发芽种子出土，但是种壳尚未脱落，注意防鸟害。采取少量多次灌溉措施。

c)条叶期：即幼苗顶端长出条状原生叶，要进行松土、除草。采取多量少次灌溉措施。

步骤5.3、间苗：为了减少水分消耗，促使幼苗茁壮成长，可等各小区幼苗生长稳定，即幼苗出齐一个月后后，将过密细弱的幼苗疏间，同时对过于稀疏的地方进行补栽。每平方米保留苗木140-160株。

步骤5.4、病害防治：马尾松幼苗出土两个月内，由于土壤和空气湿度增加，极易被病菌侵染。期最常见的病害是猝倒病、立枯病。因此在这段时间要勤观察、抓紧防治。一旦发现病情，立即将病苗拔除烧毁，然后用0.5％-1.0％的波尔多液喷洒，每7d一次。

步骤5.5、虫害防治：马尾松毛虫是最严重的马尾松害虫，喜食松针，严重影响松林生长。在育苗期间采用化学防治方法较为方便，即可将50％敌敌畏稀释2000倍；或50％杀螟松乳剂稀释1500倍。

步骤6、苗木出圃：

步骤6.1、起苗：在春季芽苞尚未萌动之前起苗。起苗之前需要利用铲子进行挖取，保证苗木根系带有宿土，不能直接用手拔，要做到：少伤侧根、须根，保持根系比较完整和不折断苗干，不伤顶芽。然后根部用薄膜进行包装，这样在有效避免根系水分蒸发的同时还能携带大量菌根土进行造林，造林后缓苗期短，生长速度快。

步骤6.2、分级：

a)根据综合控制条件、根系、地径和苗高确定苗木是否合格。综合控制条件为：无检疫对象病虫害，苗干通直、色泽正常。

b)将合格苗分为Ⅰ、Ⅱ两个等级，苗木等级划分见表3。

表3苗木质量等级表

c)苗木分级必须在庇荫背风处，分级后做好等级标志。

步骤6.3、质量检验：起苗后苗木质量检测要在一个苗批内进行，采取随机抽样的方法进行。本研究各小区随机抽取30株进行检测。游标卡尺测量地径，精确度0.05cm；直尺测量苗高和根系，精确度1cm。

步骤6.4、假植：起苗后如不能及时移植要选择排水良好、背风阴凉的地方进行假植。

步骤6.5、包装：苗木每包重量不超过30kg，每包需贴上标签，标签内容包括：树种、苗木种类、苗龄、标准代号、质量等级、数量、起苗日期。

步骤6.6、运输：运输过程要采取保湿、透气措施，防止风吹日晒，长途运输苗木要用稻草或草袋包裹。

实施例1

步骤1、种子处理：马尾松种子由重庆市林木种苗站提供，挑选无病虫害、颗粒饱满均匀的马尾松种子，在30％双氧水中震动30min进行表面消毒后，用纯水冲洗干净，置于40℃温水中浸泡24小时，然后放置到装有珍珠岩的培养皿中进行催芽，待大部分种子露白后播种。

步骤2、土壤处理：供试土壤为重庆市缙云山马尾松林下酸性冷砂黄壤，土壤经2％的甲醛溶液消毒杀菌，膜覆盖7d，揭膜翻晒晾干，7d后备用。供试土壤基本理化性质见表1。

步骤3、制备外生菌根真菌菌根菌剂：

步骤3.1、外生菌根真菌的分离和培养：外生菌根真菌为Pt 715；

菌种分离培养采用PDA培养基：将200g马铃薯洗净去皮切碎后加水1000ml煮沸30min，用纱布过滤后再加葡萄糖20g、琼脂20g充分溶解，121℃高温灭菌30min后取出备用。所有分离工作均在超净工作台上完成。选取新鲜、幼嫩、未开伞、无病虫害的完整子实体，用75％的酒精棉球表面消毒，待表面酒精挥发后，将子实体菌柄菌盖联结处掰开，用酒精和火焰消毒过的解剖刀在掰开的子实体内部取0.2cm-0.3cm大小的菌块，接在PDA平板上。将平板放入人工气候箱中25℃培养。3天后检查是否有污染，根据外生菌根真菌菌丝体是否直接从接种块上长出、生长速度以及同种真菌形成的菌落形态特征一致等特点，初步判定所分离菌种是否为外生菌根真菌纯培养物，对其生长特征进行详细观察和记录。筛选无污染、菌落形态等特征良好的各分离菌种进一步在PDA培养基上进行转接纯化，每7d一次，直至其生长稳定。4℃下保藏备用。

步骤3.2、母菌培养：将步骤3.1中分离纯化的外生菌根菌种转接到Pachlewski固体培养基上，在恒温条件下暗培养2周，作为母菌备用。Pachlewski固体培养基配方见表2。

步骤3.3、接种体培养：在超净台下，将活化的菌种用打孔法转接到经高温灭菌后的Pachlewski液体培养基上，每瓶接入面积为5mm×5mm的母菌菌块4片，室温下静置培养2周，得菌丝体。培养完成后，将菌丝体在打浆机中低速打散1min，收集菌丝体悬浮液，作为接种体。

步骤4、菌根菌剂接种：于3月份进行育苗，播种前将苗床细作整平后，铺约15cm厚的经2％甲醛消毒且过筛的马尾松林下土，

马尾松接种采用拌种法。将接种体与经2％甲醛消毒的土混合成糊状，然后与经过催芽的马尾松种子拌匀，分别撒入相应的苗床土壤中，每平方米撒播约200粒马尾松种子。播种后再在其表面覆一层细土，以不见种子为宜。然后苗床洒透水。

步骤5、苗期管理：菌根化苗木苗期管理参照GB6001-1985《育苗技术规程》执行。

步骤5.1、苗床管理：适时浇水，保持苗床湿润。同时做好排灌设施，保证水能均匀分配到各小区苗床，且试验期间不使用任何杀菌剂。

步骤5.2、各苗期注意事项：

a)种芽期：即播种后到种子吐芽，需要施放鼠药防止鼠害。控制灌溉，苗床保持湿润即可。

b)芽苗期：即发芽种子出土，但是种壳尚未脱落，注意防鸟害。采取少量多次灌溉措施。

c)条叶期：即幼苗顶端长出条状原生叶，要进行松土、除草。采取多量少次灌溉措施。

步骤5.3、间苗：为了减少水分消耗，促使幼苗茁壮成长，可等各小区幼苗生长稳定，即幼苗出齐一个月后后，将过密细弱的幼苗疏间，同时对过于稀疏的地方进行补栽。每平方米保留苗木140-160株。

步骤5.4、病害防治：马尾松幼苗出土两个月内，由于土壤和空气湿度增加，极易被病菌侵染。期最常见的病害是猝倒病、立枯病。因此在这段时间要勤观察、抓紧防治。一旦发现病情，立即将病苗拔除烧毁，然后用0.5％-1.0％的波尔多液喷洒，每7d一次。

步骤5.5、虫害防治：马尾松毛虫是最严重的马尾松害虫，喜食松针，严重影响松林生长。在育苗期间采用化学防治方法较为方便，即可将50％敌敌畏稀释2000倍；或50％杀螟松乳剂稀释1500倍。

步骤6、苗木出圃：

步骤6.1、起苗：在春季芽苞尚未萌动之前起苗。起苗之前需要利用铲子进行挖取，保证苗木根系带有宿土，不能直接用手拔，要做到：少伤侧根、须根，保持根系比较完整和不折断苗干，不伤顶芽。然后根部用薄膜进行包装，这样在有效避免根系水分蒸发的同时还能携带大量菌根土进行造林，造林后缓苗期短，生长速度快。

步骤6.2、分级：

a)根据综合控制条件、根系、地径和苗高确定苗木是否合格。综合控制条件为：无检疫对象病虫害，苗干通直、色泽正常。

b)将合格苗分为Ⅰ、Ⅱ两个等级，苗木等级划分见表3。

c)苗木分级必须在庇荫背风处，分级后做好等级标志。

步骤6.3、质量检验：起苗后苗木质量检测要在一个苗批内进行，采取随机抽样的方法进行。本研究各小区随机抽取30株进行检测。游标卡尺测量地径，精确度0.05cm；直尺测量苗高和根系，精确度1cm。

步骤6.4、假植：起苗后如不能及时移植要选择排水良好、背风阴凉的地方进行假植。

步骤6.5、包装：苗木每包重量不超过30kg，每包需贴上标签，标签内容包括：树种、苗木种类、苗龄、标准代号、质量等级、数量、起苗日期。

步骤6.6、运输：运输过程要采取保湿、透气措施，防止风吹日晒，长途运输苗木要用稻草或草袋包裹。

实施例2

步骤1、种子处理：挑选无病虫害、颗粒饱满均匀的马尾松种子，在质量浓度为25％的双氧水中震动35min进行表面消毒后，用纯水冲洗干净，置于35℃温水中浸泡28小时，然后放置到装有珍珠岩的培养皿中进行催芽，待90％以上种子露白后播种；

步骤2、土壤处理：供试土壤为马尾松林下酸性冷砂黄壤，土壤经2％的甲醛溶液消毒杀菌，膜覆盖7d，揭膜翻晒晾干，7d后备用。供试土壤基本理化性质见表1。

步骤3、制备外生菌根真菌菌根菌剂：

步骤3.1、外生菌根真菌的分离和培养：外生菌根真菌为Ld 2；

菌种分离培养采用PDA培养基：将200g马铃薯洗净去皮切碎后加水1000ml煮沸30min，用纱布过滤后再加葡萄糖20g、琼脂20g充分溶解，121℃高温灭菌30min后取出备用。所有分离工作均在超净工作台上完成。选取新鲜、幼嫩、未开伞、无病虫害的完整子实体，用75％的酒精棉球表面消毒，待表面酒精挥发后，将子实体菌柄菌盖联结处掰开，用酒精和火焰消毒过的解剖刀在掰开的子实体内部取0.2cm-0.3cm大小的菌块，接在PDA平板上。将平板放入人工气候箱中25℃培养。3天后检查是否有污染，根据外生菌根真菌菌丝体是否直接从接种块上长出、生长速度以及同种真菌形成的菌落形态特征一致等特点，初步判定所分离菌种是否为外生菌根真菌纯培养物，对其生长特征进行详细观察和记录。筛选无污染、菌落形态等特征良好的各分离菌种进一步在PDA培养基上进行转接纯化，每7d一次，直至其生长稳定。4℃下保藏备用。

步骤3.2、母菌培养：将步骤3.1中分离纯化的外生菌根菌种转接到Pachlewski固体培养基上，在恒温条件下暗培养2周，作为母菌备用。Pachlewski固体培养基配方见表2。

步骤3.3、接种体培养：在超净台下，将活化的菌种用打孔法转接到经高温灭菌后的Pachlewski液体培养基上，每瓶接入面积为5mm×5mm的母菌菌块4片，室温下静置培养2周，得菌丝体。培养完成后，将菌丝体在打浆机中低速打散1min，收集菌丝体悬浮液，作为接种体。

步骤4、菌根菌剂接种：于3月份进行育苗，播种前将苗床细作整平后，铺约15cm厚的经2％甲醛消毒且过筛的马尾松林下土，

马尾松接种采用拌种法。将接种体与经2％甲醛消毒的土混合成糊状，然后与经过催芽的马尾松种子拌匀，分别撒入相应的苗床土壤中，每平方米撒播约200粒马尾松种子。播种后再在其表面覆一层细土，以不见种子为宜。然后苗床洒透水。

步骤5、苗期管理：菌根化苗木苗期管理参照GB6001-1985《育苗技术规程》执行。

步骤5.1、苗床管理：适时浇水，保持苗床湿润。同时做好排灌设施，保证水能均匀分配到各小区苗床，且试验期间不使用任何杀菌剂。

步骤5.2、各苗期注意事项：

a)种芽期：即播种后到种子吐芽，需要施放鼠药防止鼠害。控制灌溉，苗床保持湿润即可。

b)芽苗期：即发芽种子出土，但是种壳尚未脱落，注意防鸟害。采取少量多次灌溉措施。

c)条叶期：即幼苗顶端长出条状原生叶，要进行松土、除草。采取多量少次灌溉措施。

步骤5.3、间苗：为了减少水分消耗，促使幼苗茁壮成长，可等各小区幼苗生长稳定，即幼苗出齐一个月后后，将过密细弱的幼苗疏间，同时对过于稀疏的地方进行补栽。每平方米保留苗木140-160株。

步骤5.4、病害防治：马尾松幼苗出土两个月内，由于土壤和空气湿度增加，极易被病菌侵染。期最常见的病害是猝倒病、立枯病。因此在这段时间要勤观察、抓紧防治。一旦发现病情，立即将病苗拔除烧毁，然后用0.5％-1.0％的波尔多液喷洒，每7d一次。

步骤5.5、虫害防治：马尾松毛虫是最严重的马尾松害虫，喜食松针，严重影响松林生长。在育苗期间采用化学防治方法较为方便，即可将50％敌敌畏稀释2000倍；或50％杀螟松乳剂稀释1500倍。

步骤6、苗木出圃：

步骤6.1、起苗：在春季芽苞尚未萌动之前起苗。起苗之前需要利用铲子进行挖取，保证苗木根系带有宿土，不能直接用手拔，要做到：少伤侧根、须根，保持根系比较完整和不折断苗干，不伤顶芽。然后根部用薄膜进行包装，这样在有效避免根系水分蒸发的同时还能携带大量菌根土进行造林，造林后缓苗期短，生长速度快。

步骤6.2、分级：

a)根据综合控制条件、根系、地径和苗高确定苗木是否合格。综合控制条件为：无检疫对象病虫害，苗干通直、色泽正常。

b)将合格苗分为Ⅰ、Ⅱ两个等级，苗木等级划分见表3。

c)苗木分级必须在庇荫背风处，分级后做好等级标志。

步骤6.3、质量检验：起苗后苗木质量检测要在一个苗批内进行，采取随机抽样的方法进行。本研究各小区随机抽取30株进行检测。游标卡尺测量地径，精确度0.05cm；直尺测量苗高和根系，精确度1cm。

步骤6.4、假植：起苗后如不能及时移植要选择排水良好、背风阴凉的地方进行假植。

步骤6.5、包装：苗木每包重量不超过30kg，每包需贴上标签，标签内容包括：树种、苗木种类、苗龄、标准代号、质量等级、数量、起苗日期。

步骤6.6、运输：运输过程要采取保湿、透气措施，防止风吹日晒，长途运输苗木要用稻草或草袋包裹。

实施例3

步骤1、种子处理：挑选无病虫害、颗粒饱满均匀的马尾松种子，在质量浓度为35％的双氧水中震动25min进行表面消毒后，用纯水冲洗干净，置于45℃温水中浸泡20小时，然后放置到装有珍珠岩的培养皿中进行催芽，待90％以上种子露白后播种；

步骤2、土壤处理：供试土壤为马尾松林下酸性冷砂黄壤，土壤经2％的甲醛溶液消毒杀菌，膜覆盖7d，揭膜翻晒晾干，7d后备用。供试土壤基本理化性质见表1。

步骤3、制备外生菌根真菌菌根菌剂：

步骤3.1、外生菌根真菌的分离和培养：外生菌根真菌为Ld3；

菌种分离培养采用PDA培养基：将200g马铃薯洗净去皮切碎后加水1000ml煮沸30min，用纱布过滤后再加葡萄糖20g、琼脂20g充分溶解，121℃高温灭菌30min后取出备用。所有分离工作均在超净工作台上完成。选取新鲜、幼嫩、未开伞、无病虫害的完整子实体，用75％的酒精棉球表面消毒，待表面酒精挥发后，将子实体菌柄菌盖联结处掰开，用酒精和火焰消毒过的解剖刀在掰开的子实体内部取0.2cm-0.3cm大小的菌块，接在PDA平板上。将平板放入人工气候箱中25℃培养。3天后检查是否有污染，根据外生菌根真菌菌丝体是否直接从接种块上长出、生长速度以及同种真菌形成的菌落形态特征一致等特点，初步判定所分离菌种是否为外生菌根真菌纯培养物，对其生长特征进行详细观察和记录。筛选无污染、菌落形态等特征良好的各分离菌种进一步在PDA培养基上进行转接纯化，每7d一次，直至其生长稳定。4℃下保藏备用。

步骤3.2、母菌培养：将步骤3.1中分离纯化的外生菌根菌种转接到Pachlewski固体培养基上，在恒温条件下暗培养2周，作为母菌备用。Pachlewski固体培养基配方见表2。

步骤3.3、接种体培养：在超净台下，将活化的菌种用打孔法转接到经高温灭菌后的Pachlewski液体培养基上，每瓶接入面积为5mm×5mm的母菌菌块4片，室温下静置培养2周，得菌丝体。培养完成后，将菌丝体在打浆机中低速打散1min，收集菌丝体悬浮液，作为接种体。

步骤4、菌根菌剂接种：于3月份进行育苗，播种前将苗床细作整平后，铺约15cm厚的经2％甲醛消毒且过筛的马尾松林下土，

马尾松接种采用拌种法。将接种体与经2％甲醛消毒的土混合成糊状，然后与经过催芽的马尾松种子拌匀，分别撒入相应的苗床土壤中，每平方米撒播约200粒马尾松种子。播种后再在其表面覆一层细土，以不见种子为宜。然后苗床洒透水。

步骤5、苗期管理：菌根化苗木苗期管理参照GB6001-1985《育苗技术规程》执行。

步骤5.1、苗床管理：适时浇水，保持苗床湿润。同时做好排灌设施，保证水能均匀分配到各小区苗床，且试验期间不使用任何杀菌剂。

步骤5.2、各苗期注意事项：

a)种芽期：即播种后到种子吐芽，需要施放鼠药防止鼠害。控制灌溉，苗床保持湿润即可。

b)芽苗期：即发芽种子出土，但是种壳尚未脱落，注意防鸟害。采取少量多次灌溉措施。

c)条叶期：即幼苗顶端长出条状原生叶，要进行松土、除草。采取多量少次灌溉措施。

步骤5.3、间苗：为了减少水分消耗，促使幼苗茁壮成长，可等各小区幼苗生长稳定，即幼苗出齐一个月后后，将过密细弱的幼苗疏间，同时对过于稀疏的地方进行补栽。每平方米保留苗木140-160株。

步骤5.4、病害防治：马尾松幼苗出土两个月内，由于土壤和空气湿度增加，极易被病菌侵染。期最常见的病害是猝倒病、立枯病。因此在这段时间要勤观察、抓紧防治。一旦发现病情，立即将病苗拔除烧毁，然后用0.5％-1.0％的波尔多液喷洒，每7d一次。

步骤5.5、虫害防治：马尾松毛虫是最严重的马尾松害虫，喜食松针，严重影响松林生长。在育苗期间采用化学防治方法较为方便，即可将50％敌敌畏稀释2000倍；或50％杀螟松乳剂稀释1500倍。

步骤6、苗木出圃：

步骤6.1、起苗：在春季芽苞尚未萌动之前起苗。起苗之前需要利用铲子进行挖取，保证苗木根系带有宿土，不能直接用手拔，要做到：少伤侧根、须根，保持根系比较完整和不折断苗干，不伤顶芽。然后根部用薄膜进行包装，这样在有效避免根系水分蒸发的同时还能携带大量菌根土进行造林，造林后缓苗期短，生长速度快。

步骤6.2、分级：

a)根据综合控制条件、根系、地径和苗高确定苗木是否合格。综合控制条件为：无检疫对象病虫害，苗干通直、色泽正常。

b)将合格苗分为Ⅰ、Ⅱ两个等级，苗木等级划分见表3。

c)苗木分级必须在庇荫背风处，分级后做好等级标志。

步骤6.3、质量检验：起苗后苗木质量检测要在一个苗批内进行，采取随机抽样的方法进行。本研究各小区随机抽取30株进行检测。游标卡尺测量地径，精确度0.05cm；直尺测量苗高和根系，精确度1cm。

步骤6.4、假植：起苗后如不能及时移植要选择排水良好、背风阴凉的地方进行假植。

步骤6.5、包装：苗木每包重量不超过30kg，每包需贴上标签，标签内容包括：树种、苗木种类、苗龄、标准代号、质量等级、数量、起苗日期。

步骤6.6、运输：运输过程要采取保湿、透气措施，防止风吹日晒，长途运输苗木要用稻草或草袋包裹。

下面结合具体的实验数据来说明本发明的技术效果：

按照上述苗木管理方式培育马尾松幼苗4个月后，每区组每处理随机取苗木30株，检测其菌根侵染率，测定生长指标：根重、苗重、根冠比苗高和地径，测定养分吸收：P、K、Ca、Mg、Fe。所得数据用SPSS17.0软件进行方差分析，SSR法作数据间的多重比较，显著水平设置为0.05。采用Microsoft Office Excel 2007制作图表；其中，Pt 715、Ld 2和Ld3分别对应实施例1、实施例2和实施例3；CK为未添加菌根菌剂，其余步骤同实施例1。

一、马尾松苗木的菌根感染率

培养4个月后，随机取30株幼苗检测其菌根侵染率。菌根侵染率根据具有菌根的幼苗根数占总抽取根数的百分比来计算。

如图1所示，3种供试菌株对马尾松幼苗的侵染率都达80％以上，与CK相比达到显著差异(p＜0.05)。且不同菌株对马尾松幼苗的侵染率不同，Ld2最高，达90.41％，Pt715次之，为89％，Ld3最低，为83.5％。而未接种菌根菌的对照组，未发菌根侵染。故3种供试菌株的侵染能力大小依次为Ld2＞Pt715＞Ld3。

二、菌根化苗木的生长效应

从表4可知，接种对马尾松幼苗生长的影响较大，除苗高差异不显著外，相较对照组，接种后幼苗的根重、苗重、根冠比、地径均显著增加，且差异达到显著水平(p＜0.05)。接种后幼苗的生物量影响最大，且显著促进了幼苗地下部分生长，使其根系更发达：根重较对照增加了47％-138％，增幅大小为：Pt715＞Ld2＞Ld3；苗重较对照增加了37％-60％，增幅大小为：Ld2＞Pt715＞Ld3。接种后幼苗的根冠比增加了28％-81％，增幅大小为：Pt715＞Ld2＞Ld3，这说明菌根的形成对幼苗地上和地下部分的生物量分配产生了较大影响。与对照相比，接种后苗高变化差异不显著，但是接种较对照的苗高平均提高了14.81％，增幅大小为：Ld3＞Pt715＞Ld2；接种后幼苗的地径平均增加了25％，增幅大小为：Ld2＞Ld3＞Pt715。

综上接种外生菌根真菌对马尾松促生效果明显，且3种菌株促生效果总体表现为Pt715＞Ld2＞Ld3。

表4接种不同外生菌根真菌对马尾松生长的影响

注：表中同一行中不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)

三、菌根化苗木对养分的吸收效应

接种外生菌根真菌后马尾松幼苗的P、K、Ca、Mg、Fe养分含量如图2-6所示。接种对马尾松幼苗体内养分含量影响显著，不同接种处理对养分含量的影响也不尽相同，且接种后马尾松幼苗的养分含量均显著高于对照。

磷(图2)：磷是植物生长的必需元素，植物体内的磷85％以有机磷的形式存在，如核算、蛋白质、磷脂等等。磷参与光合作用、参与各种酶促反应，植物正常生命活动深受其影响。西南地区属酸性土壤，有效磷较低，这严重限制了植物的生长。接种后幼苗的磷含量与CK相比达到显著差异(p＜0.05)。且不同菌株对马尾松幼苗的磷增量不同，Ld2最高，达112.68％，Ld3次之，为54.89％，Pt715最低，为23.55％。3种供试菌株的吸磷能力大小依次为：Ld2＞Ld3＞Pt715。

钾(图3)：钾是继氮后，林木所需的大量元素之一。植物体内钾素集中在生命活动旺盛的部位，其不仅能促进植物体内光合产物的转移和运输，还在提高植物抗性方面发挥着不可或缺的作用。接种Ld2后，幼苗钾含量较其他处理显著增加(p＜0.05)。Ld3和Pt715接种的幼苗钾含量与对照组差异不显著(p＜0.05)，但是相较对照组，其钾含量依然有所升高，分别为3.03％、2.2％。总体来说，接种增加了植物钾含量。

钙、镁、铁(图4-图6)：接种后，Ld3和Pt715增加了马尾松幼苗的钙含量，且增幅较大；而接种Ld2对钙的吸收作用不明显，反而比对照降低2.29％。镁、铁是植物生长必须的微量元素，参与植物体内各种代谢活动。马尾松幼苗镁、铁含量均显著高于未接种苗木，且Ld2增幅依然最大。

四、结论：

本发明育苗试验的供试菌株：Pt 715(Pisolithus tinctorius 715)采自于四川西昌桉树(Eucalyptus sp.)林下；Ld 2、Ld3：为松乳菇(Lactarius deliciosus(L.Fr.)Gray)的两个株系，均从重庆缙云山马尾松林下的酸性黄壤(pH值3.9～4.3)中分离获得。将菌丝分离纯培养后，以与马尾松种子拌种的方式来培育菌根化苗。通过对马尾松幼苗菌根化的效果、生长状况及养分吸收的研究，结果表明接种外生菌根真菌可以显著增加马尾松菌根侵染率、根重、苗重、根冠比、地径、苗高及植株的P、K、Ca、Mg、Fe含量。衡量外生菌根真菌接种效果最直观的表现就是植物的生长情况。说明接种外生菌根真菌对马尾松有促生作用，且效果明显。

接种3种外生菌根真菌均能与马尾松形成外生菌根，且侵染率均超过80％，这说明其能与马尾松形成良好的共生关系，但是不同菌株侵染力不同，Ld 2最强。

接种均能显著促进幼苗根重、苗高、根冠比、地径。而苗高的促生效果差异不显著，但是接种处理相较对照仍有略微增加，这可能由于马尾松培养时间较短生长初期幼苗生长速度慢所致，且马尾松顶端针叶长度没有规律，使得测量难免造成误差，因此接种对其影响不大。接种后根冠比增加，说明接种对地下部分的作用更大、幼苗根系更发达。接种幼苗总体长势：Pt 715略大于Ld 2，Ld3最小。

植物形成菌根后，作为菌根主要吸收器官的外延菌丝在植物营养吸收方面起着非常重要的作用，它的数量和长度远远超过根毛，因此接种外生菌根真菌增加了植物根的吸收面积，进而间接地增加了其对养分的吸收及利用，尤其对磷的吸收作用尤为明显。本发明结果表明：接种使得马尾松幼苗P、K、Ca、Mg、Fe含量均要高于对照，尤其对磷的吸收更明显，Ld 2磷的增幅达112.68％，这说明接种后根系对磷素的吸收作用最强。而植物对K吸收增幅并不是很明显，会因为钾为无机阳离子，其主要以主动运输方式从根尖进入植物体内，不需要进行酶促反应，而菌根主要通过形成生物酶、有机酸等分泌物来活化吸收难溶性养分，故此对钾的吸收作用不明显，而土壤中的Ca多以难溶性钙盐的形式存在，本发明结果也表明，钙是继磷之后，养分吸收效应最明显的元素。接种后幼苗Mg、Fe含量高于对照，但是增幅较小，这可能是因为其不是属于微量元素，在植物体内含量本来就不高。综上所述，接种外生菌根真菌增加了马尾松幼苗元素吸收，且对磷的吸收作用较其他元素最为明显。3种菌株对马尾松幼苗养分吸收效应作用依次为Ld2＞Ld3＞Pt715。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。