本发明涉及一种中生菌素、丁子香酚的复配组合物，尤其是该复配组合物作为杀菌剂应用于防治苹果、葡萄等果树重要病害，属于杀菌剂的复配组合物技术领域。
背景技术：
葡萄白腐病、葡萄炭疽病、苹果轮纹病、苹果炭疽病是果树主产区严重发生的重要病害之一。目前，化学杀菌剂仍是防治果树病害的主要手段，但长期大量化学农药不合理导致了防治成本增大、果品残留超标、环境污染、抗药性发生发展等问题。公众对食品安全的密切关注，全球保护环境的日益渐高的呼声，要求科研人员寻找有效并安全的防治方法，因此开发和利用与环境具有相容性、对人类无害的农药资源日益受到各国的青睐。
生物源农药亦称“生物农药”，是指利用生物资源开发的农药，其有效成分是自然存在的，具有低毒、无污染、专一性强、易于降解、在生态环境中积累毒性可能性小、具有环境相容性等特性。对需求不断增长的有机食品、绿色食品具有保证作用，避免或减轻了应用化学农药造成的负面影响，且具有使病原菌难以产生抗药性等优点，是理想的农药类型。
中生菌素是由淡紫灰链霉菌海南变种产生的抗生素，属n－糖苷类碱性水溶性物质。其作用机理主要是主要通过对细菌是抑制菌体蛋白质的合成，导致菌体死亡；对真菌是使丝状菌丝变形，抑制孢子萌发并能直接杀死孢子。中生菌素具有触杀、渗透作用，对农作物的细菌性病害及部分真菌性病害具有很高的活性，同时具有一定的增产作用。还未检索到作物致病菌对其产生抗药性。
植物源农药丁子香酚存在于丁香油、肉桂叶油、肉桂皮油、樟脑油、肉豆蔻油等中，可由丁香油中分出。丁子香酚由植物的叶、茎、根部吸收，并有向上传导功能且安全、环保无残留，药效迅速，持效期长。已发病的作物喷药后，菌孢子马上变型，被溶解消失。近年来丁子香酚备受临床医生、科研界和患者的关注，同时也被科研单位和厂家用作农药推广应用。丁子香酚和中生菌素复配用于防治苹果轮纹病、苹果炭疽病、葡萄白腐病、葡萄炭疽病还未见报道。
技术实现要素：
本发明目的在于提供防治苹果轮纹病、葡萄白腐病等重要果树病害的中生菌素、丁子香酚单剂及其复配组合物。本发明探讨了中生菌素与丁子香酚复配组合物在农业领域中的应用，尤其是针对苹果轮纹病、葡萄白腐病等重要病害防治研究而完成的。
本发明是通过以下技术方案实现的：
中生菌素与丁子香酚的复配组合物，特殊之处在于有效成分中生菌素与丁子香酚的重量配比为70:1～1:70；
中生菌素与丁子香酚的复配组合物，进一步的改进在于，其有效成分中生菌素与丁子香酚的增效重量配比为40:1～1:10；
中生菌素与丁子香酚的复配组合物，更进一步的改进在于，其有效成分中生菌素与丁子香酚的最佳比例为10:1，增效系数为2.18；
中生菌素与丁子香酚的复配组合物，其有效成分中生菌素与丁子香酚在整个复配组合物中的总重量占复配组合物的2.2％，余量为常规辅料添加物。
本发明的中生菌素与丁子香酚的复配组合物应用于防治苹果轮纹病、苹果炭疽病、葡萄白腐病、葡萄炭疽病。
本发明还提供上述中生菌素与丁子香酚的复配组合物的使用方法，其特殊之处在于，将中生菌素与丁子香酚的复配组合物稀释600-800倍下应用防治苹果轮纹病、苹果炭疽病、葡萄白腐病、葡萄炭疽病具有较好的防效。
本发明中生菌素与丁子香酚复配组合物具有以下优点：
1、具有增效作用。室内毒力测定结果表明，中生菌素、丁子香酚对葡萄白腐病菌两者在40:1～1:10范围内呈现增效作用，其中以10:1的增效作用最为显著，增效系数达2.18。
2、最佳配比田间桶混防效突出，且减少了制剂用量。我院制成2.2％中生菌素·丁子香酚复配组合物600-800倍在田间防治苹果轮纹病、苹果炭疽病、葡萄白腐病、葡萄炭疽病的药效试验中表现突出，优于或相当于单剂、对照药剂的防治效果。同时，大幅减少制剂用量，同直接按照标签浓度桶混相比，复配组合物600倍、800倍分别减少制剂用量33％、50％。
3、高安全性。丁子香酚、中生菌素对人畜毒性低，我院制得的复配组合物低于市场单剂有效成分的含量，对作物、环境和鲜果食用者更为安全。
4、降低了致病菌抗药性产生的风险。如优势2所述，复配组合物中生菌素与丁子香酚的用量明显低于市销单剂产品，且田间使用时制剂用量明显减少，这可大幅降低葡萄白腐病菌等致病菌对这两种杀菌剂的选择压力。此外，中生菌素、丁子香酚作用机理不同，桶混使用更不易使致病菌产生抗药性。
具体实施方式
本发明用以下具体实例进行详细说明，但绝非对本发明的限制。所有配比中百分比均为重量百分比。
实施例1
室内毒力测定与复配比例筛选
1.1供试药剂
12％中生菌素可湿性粉剂，福建凯立生物制品有限公司产品，溶于水配成1000mg/l母液备用。
0.3％丁子香酚可溶液剂，山东省亿嘉农化有限公司产品，溶于水配成1000mg/l母液备用。
1.2供试菌株
葡萄白腐病(coniothyriumdiplodiella)自田间病果上分离获得，单孢培养纯化得到的第一代菌株，4℃冰箱内保存备用。
1.3仪器设备
仪器设备主要有电子天平、超净工作台、生物培养箱、培养皿、移液器等。1.4实验方法
采用fao推荐的菌体生长速率法(myceliumgrowthratetest)。
1.4.1药剂复配
表1中生菌素与丁子香酚复配比例
表2复配药剂稀释浓度梯度
1.4.2含药平板的制备
按照1.4.1设定的药剂浓度梯度，将药剂加入定量溶化的pda培养基中，制成含药平板，以不含药平板为空白对照，每浓度重复3次。
1.4.3接菌培养
用直径0.6㎝打孔器沿培养好的菌落边缘打取菌盘，用消毒接种针将菌盘反转移植到平板上，置于25℃条件下恒温培养6天。
1.4.4结果调查
以直尺交叉测量法测量菌落扩展直径，与不施药对照菌盘扩展直径相比，计算出药剂对菌丝生长的抑制率。
1.5统计分析
根据各药剂浓度对数值及对应的菌丝生长抑制率几率值作回归分析，计算各药剂毒力回归方程、相关系数(r)和ec50。
进行药剂联合毒力测定时，根据wadley法计算复配组合物的增效系数(sr)，评价复配组合物的联合作用类型。根据增效系数(sr)来评价药剂复配的增效作用，即sr<0.5为拮抗作用，0.5≤sr≤1.5为相加作用，sr>1.5为增效作用。增效系数(sr)按式(1)、(2)计算：
式中：
x1----复配组合物ec50理论值，单位为mg/l；
pa----复配组合物中a的百分含量，单位为百分率(％)；
pb----复配组合物中b的百分含量，单位为百分率(％)；
a----a的ec50值，单位为mg/l；
b----b的ec50值，单位为mg/l。
式中：
sr----复配组合物的增效系数；
x1----复配组合物ec50理论值，单位为mg/l；
x2----复配组合物ec50实测值，单位为mg/l。
1.6结果分析
通过室内毒力实验，结果表明两种单剂室内对葡萄白腐病菌均表现出良好的抑制效果，ec50分别为3.1942mg/l和0.7089mg/l。中生菌素和丁子香酚两者有效成分比例为40:1～1:10时均表现出增效作用，尤其10:1配比增效最为显著，其ec50为1.1098mg/l，增效系数为2.18。说明，中生菌素·丁子香酚10:1复配杀菌剂对葡萄白腐病具有很高的杀菌活性。
表3中生菌素与丁子香酚最佳复配比例筛选
实施例2
田间小区试验
根据室内复配比例筛选实验筛选出中生菌素:丁子香酚＝10:1为最佳配比，我们配制了2.2％的中生菌素·丁子香酚复配组合物。按照农业部农药检定所主编的《农药田间药效试验准则(二)》第13、121、181部分设计2.2％中生菌素·丁子香酚复配组合物对苹果轮纹病、苹果炭疽病、葡萄白腐病、葡萄炭疽病的田间药效试验。
2.1供试药剂
0.3％丁子香酚可溶液剂600倍，山东省亿嘉农化有限公司产品；
3％中生菌素可湿性粉剂600倍，山东兆丰年生物科技有限公司产品；
2.2％中生菌素·丁子香酚600倍、800倍、1000倍，烟台农科院配制。
2.2小区设计
试验共设7个处理，每处理4个重复，共设28个小区，每小区6棵成株树。各小区随机排列。施药器械采用工农26型高压机动喷雾器，以树冠内全部枝梢叶片均匀着药，滴水为止。
2.3调查时间与方法
采收期每小区选中央3-4株，调查全部果实，记录总果数、病果数，以病果率计算防效。
2.4药效计算方法
2.5试验结果
2.2％中生菌素·丁子香酚复配杀菌剂600、800倍对葡萄白腐病均表现出良好的防效，防效分别为88.57％、85.30％。其中复配杀菌剂600倍液5％水平上显著优于3％中生菌素600倍及0.3％丁子香酚600倍两单剂的防效，且与3％中生菌素可湿性粉剂600倍+0.3％丁子香酚可溶液剂600倍桶混没有显著差异。复配杀菌剂800倍液防效虽在5％水平上显著低于上述桶混，但是防效亦在85％以上，且与3％中生菌素可湿性粉剂600倍没有显著差异、5％水平上显著优于0.3％丁子香酚可溶液剂600倍防效。充分说明，4.2％中生菌素·丁子香酚复配杀菌剂对葡萄白腐病的杀菌活性较强。(表4)。
表42.2％中生菌素·丁子香酚复配组合物防治葡萄白腐病田间药效
复配组合物2.2％中生菌素·丁子香酚复配杀菌剂600、800倍对葡萄炭疽病的防效分别为87.62％、85.30％。其中复配杀菌剂600倍防效5％水平上显著优于3％中生菌素可湿性粉剂600倍及0.3％丁子香酚可溶液剂600倍两单剂的防效，且与3％中生菌素可湿性粉剂600倍+0.3％丁子香酚可溶液剂600倍桶混没有显著差异。复配杀菌剂800倍液防效与3％中生菌素可湿性粉剂600倍没有显著差异、5％水平上显著优于0.3％丁子香酚可溶液剂600倍防效(表5)。
表52.2％中生菌素·丁子香酚复配组合物防治葡萄炭疽病田间药效
2.2％中生菌素·丁子香酚复配杀菌剂对苹果轮纹病的田间防治结果表明：复配杀菌剂600、800倍防效5％水平上显著优于3％中生菌素可湿性粉剂600倍及0.3％丁子香酚可溶液剂600倍两单剂的防效，且与3％中生菌素可湿性粉剂600倍+0.3％丁子香酚可溶液剂600倍桶混没有显著差异(表6)。
表62.2％中生菌素·丁子香酚复配组合物防治苹果轮纹病田间药效
2.2％中生菌素·丁子香酚复配杀菌剂600倍、800倍防治苹果炭疽病防效分别为88.61％、85.66％，皆在5％水平上显著优于3％中生菌素可湿性粉剂600倍及0.3％丁子香酚可溶液剂600倍两单剂的防效，且与3％中生菌素可湿性粉剂600倍+0.3％丁子香酚可溶液剂600倍桶混没有显著差异。
表72.2％中生菌素·丁子香酚复配组合物防治苹果炭疽病田间药效
实施例3
安全性试验
复配组合物中中生菌素和丁子香酚含量小于市售产品的含量，因此其对人畜的毒性与作物的安全性是符合要求的。复配杀菌剂经认定机构毒性试验结果表明属于微毒类农药：
大鼠急性经口毒性ld50♂>5000mg/kg，♀>5000mg/kg；
大鼠急性经皮毒性ld50♂>5000mg/kg，♀>5000mg/kg；
兔眼刺激积分为0(1h)，48h后为0(1:100)稀释，对眼无刺激性；
兔眼刺激积分为0(4h)，对皮肤无刺激性。
本发明通过室内毒力测定和田间试验生物源农药中生菌素和丁子香酚单独使用和复配后对葡萄、苹果主要病害的效果，确立了两农药的最优配比，供生产使用，以达到减少农药环境污染、控制病菌抗药性发生发展的目的。