本发明涉及一种组织培养育苗技术，尤其涉及一种独蒜兰继代培养基及其制备方法。
背景技术：
独蒜兰pleionebulbocodioides(franch.)rolfe，兰科独蒜兰属，地生或附生草本。生长于海拔1100-3500米的林下或林缘多石地上或苔藓覆盖的岩石上，也常见于草坡稍阴蔽的砾石地上。主要分布在中国四川西南部(越西、盐源、石棉、西昌、木里)、贵州西部至北部(凯里、印江、雷山、贵阳、梵净山、盘县、安龙、望谟、纳雍)、云南西北部至东南部(贡山、维西、丽江、大理、漾濞、永宁、蒙自、文山)和西藏东南部(察瓦龙)，缅甸北部也有分布。以根茎入药，具有清热解毒、消肿散节、化痰止咳的功效，多用于气喘咳嗽及关节肿胀，毒蛇咬伤的治疗等。独蒜兰花色独特漂亮，具有较高的观赏价值，花葶从无叶的老假鳞茎基部发出，直立，顶端具一花，花紫色、淡紫色、粉红色或有时近白色，唇瓣上具有紫色或深红色斑，花期4-5月，果期9-10月。
目前市场上流通的独蒜兰多为野生，少数为人工栽培；独蒜兰繁殖多为分株繁殖，在自然环境中花粉授粉率较小，长出果荚的数量也较少，种子胚发育不全，只能在无菌条件下播种于培养基中进行组织培养。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种独蒜兰继代培养基。采用本发明的继代培养基进行组织培养优点在于克服种子胚发育不全，自然环境下繁殖率低等问题；能够有效提高独蒜兰种苗繁育的速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现独蒜兰优质种子种苗的工厂化生产，满足观赏、药用需求，减少野生资源泛滥采挖的情况。
本发明的目的之二在于提供一种独蒜兰继代培养基的制备方法。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：一种独蒜兰继代培养基为1/2ms培养基，该1/2ms培养基中添加了2.0g/l的蔗糖、4.8g/l的琼脂粉、0.2mg/l的吲哚乙酸、1.8mg/l的6-苄基腺嘌呤、30-50g/l的土豆汁、0.3g/l的活性碳粉。
进一步地，所述独蒜兰继代培养基的ph值为5.8-6.0。
进一步地，所述1/2ms培养基由如下组分组成：硝酸钾1890-1900mg/l，硝酸铵1640-1650mg/l，二水氯化钙440-445mg/l，七水硫酸镁370-375mg/l，磷酸二氢钾160-170mg/l，碘化钾0.8-0.83mg/l，硼酸6.0-6.2mg/l，四水硫酸锰22.3-23.0mg/l，七水硫酸锌8.6-9.0mg/l，钼酸钠0.2-0.25mg/l，五水硫酸铜0.025-0.028mg/l，氯化钴0.028-0.03mg/l，硫酸亚铁27.5-29mg/l，乙二胺四乙酸二钠23-25mg/l，肌醇96-100mg/l，烟酸0.2-0.3mg/l，盐酸吡哆醇0.25-0.35mg/l，盐酸硫胺素0.2-0.3mg/l，甘氨酸0.8-0.9mg/l。
进一步地，所述1/2ms培养基由如下组分组成：硝酸钾1895mg/l，硝酸铵1645mg/l，二水氯化钙442.5mg/l，七水硫酸镁372.5mg/l，磷酸二氢钾165mg/l，碘化钾0.82mg/l，硼酸6.1mg/l，四水硫酸锰22.7mg/l，七水硫酸锌8.8mg/l，钼酸钠0.22mg/l，五水硫酸铜0.026mg/l，氯化钴0.029mg/l，硫酸亚铁28mg/l，乙二胺四乙酸二钠24mg/l，肌醇98mg/l，烟酸0.25mg/l，盐酸吡哆醇0.3mg/l，盐酸硫胺素0.25mg/l，甘氨酸0.85mg/l。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：一种独蒜兰继代培养基的制备方法，包括，
溶液预配步骤：分别配制大量元素溶液、微量元素溶液、铁盐溶液、有机组分溶液和土豆汁；
混合步骤：将大量元素溶液、微量元素溶液、铁盐溶液、有机组分溶液、土豆汁、吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤、活性碳粉、蔗糖和琼脂粉混合，调节ph后、定容、灭菌、冷却、凝固，即得独蒜兰继代培养基。
进一步地，在溶液预配步骤中，所述大量元素溶液的配制方法如下：取配方量的硝酸钾、硝酸铵、二水氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾分别溶解，然后硝酸钾、硝酸铵、七水硫酸镁、磷酸二氢钾混合定容到10l的容器储存，二水氯化钙定容到10l的容器单独储存，备用。
进一步地，在溶液预配步骤中，所述微量元素溶液的配制方法如下：取配方量的碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、钼酸钠、五水硫酸铜、氯化钴，分别溶解后混合定容到5l的容器中储存，备用。
进一步地，在溶液预配步骤中，所述铁盐溶液的配制方法如下：取配方量的硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠溶解后混合定容到5l的棕色瓶中，避光保存，备用。
进一步地，在溶液预配步骤中，所述有机组分溶液的配制方法如下：取配方量的烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸溶解后定容到5l的容器中储存备用。
进一步地，所述混合步骤的具体操作如下：分别量取配方量的大量元素溶液、微量元素溶液、铁盐溶液、有机组分溶液加入1l的容器中，然后将0.2-0.3g肌醇、2g/l的蔗糖、4.8g/l的琼脂粉、0.2mg/l的吲哚乙酸、1.8mg/l的6-苄基腺嘌呤、30-50g/l土豆汁、0.3g/l的活性碳粉溶解后混合定容到上述1l的容器内，将容器加热到琼脂粉融化，用酸碱指示剂将培养基的ph调至5.8-6.0；将培养基分装到培养瓶30-40ml/瓶，盖紧瓶盖，将培养瓶放到温度为121-125℃、压力为0.15-0.3mpa的灭菌条件下灭菌20-30min，灭菌完毕出锅，拧紧培养瓶盖放到培养基储放室，待其冷却凝固即为继代培养基。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
采用本发明的继代培养基进行组织培养优点在于克服种子胚发育不全，自然环境下繁殖率低等问题；能够有效提高独蒜兰种苗繁育的速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现独蒜兰优质种子种苗的工厂化生产，满足观赏、药用需求，减少野生资源泛滥采挖的情况。同时组织培养为独蒜兰提供适宜的温湿度、光照条件，充足的营养成分，增长光照时间，增加植株的生长速度，保证植株的成活率。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
一种独蒜兰继代培养基为1/2ms培养基，该1/2ms培养基中添加了2.0g/l的蔗糖、4.8g/l的琼脂粉、0.2mg/l的吲哚乙酸、1.8mg/l的6-苄基腺嘌呤、30-50g/l的土豆汁、0.3g/l的活性碳粉。
作为进一步的实施方式，所述独蒜兰继代培养基的ph值为5.8-6.0。
作为进一步的实施方式，所述1/2ms培养基由如下组分组成：硝酸钾1890-1900mg/l，硝酸铵1640-1650mg/l，二水氯化钙440-445mg/l，七水硫酸镁370-375mg/l，磷酸二氢钾160-170mg/l，碘化钾0.8-0.83mg/l，硼酸6.0-6.2mg/l，四水硫酸锰22.3-23.0mg/l，七水硫酸锌8.6-9.0mg/l，钼酸钠0.2-0.25mg/l，五水硫酸铜0.025-0.028mg/l，氯化钴0.028-0.03mg/l，硫酸亚铁27.5-29mg/l，乙二胺四乙酸二钠23-25mg/l，肌醇96-100mg/l，烟酸0.2-0.3mg/l，盐酸吡哆醇0.25-0.35mg/l，盐酸硫胺素0.2-0.3mg/l，甘氨酸0.8-0.9mg/l。
作为最优选的实施方式，所述1/2ms培养基由如下组分组成：硝酸钾1895mg/l，硝酸铵1645mg/l，二水氯化钙442.5mg/l，七水硫酸镁372.5mg/l，磷酸二氢钾165mg/l，碘化钾0.82mg/l，硼酸6.1mg/l，四水硫酸锰22.7mg/l，七水硫酸锌8.8mg/l，钼酸钠0.22mg/l，五水硫酸铜0.026mg/l，氯化钴0.029mg/l，硫酸亚铁28mg/l，乙二胺四乙酸二钠24mg/l，肌醇98mg/l，烟酸0.25mg/l，盐酸吡哆醇0.3mg/l，盐酸硫胺素0.25mg/l，甘氨酸0.85mg/l。
该独蒜兰继代培养基的制备方法，包括，
溶液预配步骤：分别配制大量元素溶液、微量元素溶液、铁盐溶液、有机组分溶液和土豆汁；
混合步骤：将大量元素溶液、微量元素溶液、铁盐溶液、有机组分溶液、土豆汁、吲哚乙酸、6-苄基腺嘌呤、活性碳粉、蔗糖和琼脂粉混合，调节ph后、定容、灭菌、冷却、凝固，即得独蒜兰继代培养基。其中，土豆汁的制备过程如下：取30-50g土豆倒入1l无菌水中粉碎，形成含土豆粉的土豆汁。
作为进一步的实施方式，在溶液预配步骤中，所述大量元素溶液的配制方法如下：取配方量的硝酸钾、硝酸铵、二水氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾分别溶解，然后硝酸钾、硝酸铵、七水硫酸镁、磷酸二氢钾混合定容到10l的容器储存，二水氯化钙定容到10l的容器单独储存，备用。氯化钙混合到其他大量元素中容易产生沉淀，所以单独存放。
作为进一步的实施方式，在溶液预配步骤中，所述微量元素溶液的配制方法如下：取配方量的碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、钼酸钠、五水硫酸铜、氯化钴，分别溶解后混合定容到5l的容器中储存，备用。
作为进一步的实施方式，在溶液预配步骤中，所述铁盐溶液的配制方法如下：取配方量的硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠溶解后混合定容到5l的棕色瓶中，避光保存，备用。
作为进一步的实施方式，在溶液预配步骤中，所述有机组分溶液的配制方法如下：取配方量的烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸溶解后定容到5l的容器中储存备用。
作为进一步的实施方式，所述混合步骤的具体操作如下：分别量取配方量的大量元素溶液、微量元素溶液、铁盐溶液、有机组分溶液加入1l的容器中，然后将0.2-0.3g肌醇、2g/l的蔗糖、4.8g/l的琼脂粉、0.2mg/l的吲哚乙酸、1.8mg/l的6-苄基腺嘌呤、30-50g/l土豆汁、0.3g/l的活性碳粉溶解后混合定容到上述1l的容器内，将容器加热到琼脂粉融化，用酸碱指示剂将培养基的ph调至5.8-6.0；将培养基分装到培养瓶30-40ml/瓶，盖紧瓶盖，将培养瓶放到温度为121-125℃、压力为0.15-0.3mpa的灭菌条件下灭菌20-30min，灭菌完毕出锅，拧紧培养瓶盖放到培养基储放室，待其冷却凝固即为继代培养基。
以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。
实施例1-3独蒜兰继代培养基
分别按下表1中的配比秤取原料，按照如下步骤进行制备，不同之处在于所添加的原料配比不同，制备独蒜兰继代培养基品，具体详见表1：
表1：实施例1-3的原料配比表
上述独蒜兰继代培养基的制备方法，包括，
溶液预配步骤：分别配制大量元素溶液、微量元素溶液、铁盐溶液、有机组分溶液和土豆汁。具体如下：所述大量元素溶液的配制方法如下：取配方量的硝酸钾、硝酸铵、二水氯化钙、七水硫酸镁、磷酸二氢钾分别溶解，然后硝酸钾、硝酸铵、七水硫酸镁、磷酸二氢钾混合定容到10l的容器储存，二水氯化钙定容到10l的容器单独储存，备用。所述微量元素溶液的配制方法如下：取配方量的碘化钾、硼酸、四水硫酸锰、七水硫酸锌、钼酸钠、五水硫酸铜、氯化钴，分别溶解后混合定容到5l的容器中储存，备用。所述铁盐溶液的配制方法如下：取配方量的硫酸亚铁、乙二胺四乙酸二钠溶解后混合定容到5l的棕色瓶中，避光保存，备用。所述有机组分溶液的配制方法如下：取配方量的烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸溶解后定容到5l的容器中储存备用。
混合步骤：具体操作如下：分别量取配方量的大量元素溶液、微量元素溶液、铁盐溶液、有机组分溶液加入1l的容器中，然后将0.2-0.3g肌醇、2g/l的蔗糖、4.8g/l的琼脂粉、0.2mg/l的吲哚乙酸、1.8mg/l的6-苄基腺嘌呤、30-50g/l土豆汁、0.3g/l的活性碳粉溶解后混合定容到上述1l的容器内，将容器加热到琼脂粉融化，用酸碱指示剂将培养基的ph调至5.8-6.0；将培养基分装到培养瓶30-40ml/瓶，盖紧瓶盖，将培养瓶放到温度为121-125℃、压力为0.15-0.3mpa的灭菌条件下灭菌20-30min，灭菌完毕出锅，拧紧培养瓶盖放到培养基储放室，待其冷却凝固即为继代培养基。
效果评价及指标检测
采用实施例1-3的独蒜兰继代培养基对独蒜兰进行培养基组培育苗，以传统的直接播种到大田的方式育苗为对比例1，每组的独蒜兰种子数量为100颗，对培养结果各项指标进行统计结果如表2：
表2实施例1-3的独蒜兰继代培养基以及对比例的直播式
对独蒜兰进行生根培养的结果
传统的独蒜兰育种方法是将独蒜兰种子直接播种到大田，直播存在很多的问题，撒播不均，长势不好；受温度、干湿度的影响，生长速度慢。采用本发明的继代培养基进行组织培养优点在于克服种子胚发育不全，自然环境下繁殖率低等问题；能够有效提高独蒜兰种苗繁育的速度及繁育数量，从母本源头控制种质的稳定性，保证种苗质量，实现独蒜兰优质种子种苗的工厂化生产，满足观赏、药用需求，减少野生资源泛滥采挖的情况。同时组织培养为独蒜兰提供适宜的温湿度、光照条件，充足的营养成分，增长光照时间，增加植株的生长速度，保证植株的成活率。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。