本发明属于生物质能源
技术领域：
：。涉及一种促进紫萍淀粉高产的方法，能促进紫萍淀粉的高水平积累，主要用于提高人工培养紫萍的淀粉产量，可以推广于浮萍淀粉生物质能源的开发应用领域。
背景技术：
：：浮萍是高等水生植物，属于浮萍科(lemnaceae)，个体小，结构简单，主要通过无性繁殖方式进行繁衍，在合适的生长条件下，个体数在2天内就能加倍，而且浮萍光合效率高，合成淀粉能力强(28吨/公顷/年，远高于玉米6吨/公顷/年)(cheng和stomp,2009；http://faostat3.fao.org，2015)，对生长环境要求又较低，能够在一些污染程度不太严重的湖泊或污水或高营养工业废水水体中生存，并且可以充分利用污水实现规模化、工业化生成淀粉，直接用于生产生物燃料乙醇、甲烷等，或开发为多种生物产品,同时发挥修复水体的作用。研究显示浮萍淀粉的合成和积累都发生在浮萍叶状体的叶绿体或休眠芽的前质体中，淀粉的合成与其生长发育阶段和环境条件变化密不可分，有些浮萍在特定培养条件下，环境条件如温度、光照、培养液的ph值和营养物的供给、胁迫及激素处理等都会影响浮萍淀粉的合成和积累(cheng和stomp，2009；cui等2011；xu等2011；yin等2015,wang等,2016)。其中低温、营养胁迫、赤霉素生物合成抑制剂处理，能显著促进浮萍淀粉的积累，主要是通过这些不利环境和抑制生长因素影响了浮萍的无性生长，使光合产物以淀粉形式积累(xiao等，2013，liu等，2015,huang等2014)。紫萍(spirodelapolyrhiza)，属于浮萍科紫萍属，为一年生多根浮水草本。在我国最为常见。很少开花。以出芽方式繁殖。叶状体较大，有效光合面积较常见的浮萍(又称青萍，limorminor)大，又很容易培养、生长速度快，木质素和纤维素含量低，对后期淀粉的乙醇发酵几乎没有影响，是非常适合的生物质能淀粉的原料来源。然而紫萍淀粉含量在正常培养条件下仅为4％左右。虽然相关报道显示通过改变环境条件和营养物的供给与胁迫处理，可以提高浮萍淀粉的积累水平，但是如果推广应用到生产实践，将会增加设备成本和培养过程管理的费用，因为需要较为严格的培养环境设施，以提供高温或低温或高光照条件等，而且需要不断配制营养缺乏或特定的培养基。技术实现要素：本发明目的是克服现有技术存在的上述不足，解决常规培养条件下进行绿色环保生物能源的简单生产问题，提供一种促进紫萍淀粉高产又简单环保的实用方法。本发明技术方案一种促进紫萍淀粉高产又简单环保的方法，该方法的处理步骤如下：在60％dakto培养液中扩繁后的紫萍置于一个大的平皿或容器中，挑取生长状态一致的紫萍转接入加有浓度为50ppm至300ppm青鲜素的培养液中，培养光周期是12h光照/8h黑暗，光照强度约为100μmol/m2·s，温度为20-23℃，进行培养10-14d后，进行叶状体数目的计数，叶绿素荧光参数、鲜重、干重和淀粉含量的测定。所述紫萍的培养条件是：光周期是12h光照/8h黑暗，光照强度约为100μmol/m2·s，温度为22℃条件下，前期培养扩繁1周，后期青鲜素处理12天。所述的紫萍培养液为略作修改的60％datko培养液(wangandkandeler,1994)，具体配方为：表160％datko培养液所含成分及各成分浓度table1componentsofdatkomediumandconcentrationofeverycomponent所述培养基需要调节ph至5.8～6.0，121℃高温灭菌20min后待用。所述青鲜素先配制成10mg/ml青鲜素母液，具体的配制方法如下：称取500mg青鲜素，放入烧杯中，加入1ml二乙醇胺，加入少量水，搅匀，待青鲜素全部溶解后定容至50ml，用0.22μm的滤膜过滤除菌，备用。青鲜素的具体作用浓度分别是0ppm、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm。所述原初转接的紫萍株树是6株。所述测定分析指标都是在12天培养结束后进行，具体包括：(1)叶状体数目的计数：计数每瓶全部的紫萍叶状体数目，计数方法见附图1；(2)叶绿素荧光参数的测定：每瓶挑取4株，进行光合最大量子效率(fv/fm)和快速光诱导曲线的测定；(3)鲜重和干重的测定：抽滤去掉每瓶培养材料的培养液，称取每瓶的全部叶状体，获得每瓶的鲜重。其中3瓶材料分别烘干并称重，获得干重。(4)淀粉的提取：从另外称取过鲜重的3瓶材料中分别称取1g进行研磨和淀粉的提取。(5)淀粉含量的测定：对上述提取的淀粉进行含量分析。所述技术共重复5次，每次每个浓度都有6个重复。本发明的优点和积极效果：本发明采用不同浓度青鲜素对紫萍进行处理，发现在100ppm较低浓度青鲜素的作用下，紫萍新叶状体的生长几乎被抑制，与对照相比显示，在100ppm青鲜素的作用下，其叶状体由原来的6株24片成熟叶状体扩繁到约100片成熟叶状体，25片不成熟叶状体，远低于对照的350和50片成熟和不成熟叶状体(如附图2和3)；其鲜重和干重降低，与对照的约为0.75g和51mg相比，仅约为0.22g和28mg(如附图4和5)；而其叶状体的叶绿素荧光参数中最大量子效率(fv/fm)和相对电子传递速率(retr)均有所增加，与对照fv/fm相比，青鲜素处理组的fv/fm由0.805增加到0.812，同时在200-1000μmol/m2·s光照条件下，其retr高于对照约10左右(如附图6和7)。上述数据说明在低浓度100ppm青鲜素作用下，紫萍的出芽繁殖被抑制，而光合作用并未受到抑制，反而可以在200-1000μmol/m2·s光照条件下，一定程度促进了光合作用过程中的相对电子传递速率。表明紫萍在100ppm青鲜素的作用下，光合能力并未受到抑制，所以通过光合作用积累的碳水化合物就增多，而此时受青鲜素的作用，出芽繁殖被抑制，大大减少或几乎没有了营养消耗，使得光合产物主要以淀粉形式积累，所以淀粉含量显著增加，大约由对照的4.8％(w/w)增加到46.5％(w/w)(如附图8)。本发明使最常见的最容易培养的紫萍淀粉生物质能的产业化生产更加高效，特别是不依赖于严格培养环境条件和设施以促进紫萍淀粉的高产，本发明对培养环境要求低，不是特别依赖于环境温度、光照和营养物的胁迫处理，如不需要通过加热设备提供高温或压缩机降低温度，也不需要提供特别的高光照，或改变培养液的ph和营养成分等的胁迫处理。仅是通过在常规的低光照，光照强度在100-300μmol/m2·s的范围内均可，温度只要是适宜植物生长的22度左右条件下培养就可以促进淀粉的高积累。本发明所用青鲜素为低毒农药，在果蔬生产中广泛使用。而且由于青鲜素促进紫萍淀粉高积累的最佳使用浓度较低，为100ppm(100mg/kg)，低于在盛花期后喷施荔枝的青鲜素作用浓度(1000mg/kg)。另外，通过对处理57d后成熟的荔枝果实进行青鲜素残留量分析发现，荔枝果肉中无青鲜素残留(徐爱东，2009)。我们使用青鲜素处理紫萍，收获后是用于淀粉的提取和发酵，并非食用，不存在农药的二次污染问题；如果该技术能获得推广，由于是在固定的培养池进行培养，青鲜素不会对周边土壤造成污染，而且因为青鲜素的残留期为1-2个月(徐爱东，2009)，因此采用青鲜素促进紫萍淀粉的积累方法也不会对环境造成危害。本发明对紫萍是进行短时间处理，青鲜素处理12-16天就可以促进紫萍淀粉的大量积累。所以，可以在合适紫萍的整个生长季不断进行紫萍的预培养，扩繁之后，就可以用青鲜素进行短时间处理，以收获紫萍进行淀粉的提取。以天津地区为例，保守的估算，一年中在室外常规环境条件下，紫萍可以培养至少5个月，每个月又可以处理2批，这样单位面积养殖池的利用率和淀粉的年产量将会大幅提升。附图说明图1是紫萍叶状体的计数方法。图2是不同浓度青鲜素处理紫萍后生长情况的比较，图中从左至右青鲜素浓度依次为0ppm、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm。图3是不同浓度青鲜素处理紫萍后对紫萍叶状体数目的影响。图4是不同浓度青鲜素处理对紫萍鲜重的影响。图5是不同浓度青鲜素处理对紫萍干重的影响。图6是不同浓度青鲜素处理对紫萍最大光合能力的影响。图7是不同浓度青鲜素处理对紫萍快速光合曲线的影响。图8是不同浓度青鲜素处理对紫萍淀粉含量的影响(％(w/w鲜重))。图9是100ppm青鲜素处理紫萍不同时间对紫萍叶状体数目的影响。图10是100ppm青鲜素处理紫萍不同时间对紫萍鲜重的影响。图11是100ppm青鲜素处理紫萍不同时间对紫萍淀粉含量的影响。具体实施方式实施例1：将在培养光周期是12h光照/8h黑暗，光照强度约为100μmol/m2·s，温度为22℃条件下，50ml三角培养瓶培养扩繁1周后的紫萍，置于一个大的平皿中，尽可能挑取生长状态一致的紫萍，分别挑取6株，分别转接入对应各组加有0ppm、50ppm、100ppm、150ppm、200ppm、300ppm、500ppm不同浓度青鲜素的datko培养液中，进行培养12d。培养条件同样是光周期12h光照/8h黑暗，光照强度约为100μmol/m2·s，温度为22℃。12d后对紫萍分别进行如下处理：1.观察并计数每瓶培养材料的紫萍叶状体数目。把成熟的叶状体和不成熟的叶状体分开，单独进行计数。结果如附图2和3所示，到第12天时，由图2照片和图3叶状体的数目统计结果显示在低浓度50ppm青鲜素的作用下，紫萍的无性扩繁受到了较为轻微的影响，随着青鲜素浓度的增加，从100-300ppm紫萍的无性扩繁就受到不同程度的抑制。2.叶绿素荧光参数的测定12天后，每瓶挑取3株生长良好的紫萍进行叶绿素荧光参数的测定。首先将材料取出先黑暗处理20min后，将叶状体夹入暗适应叶夹，使用超便携式调制叶绿素荧光仪mini-pam-ii测量慢速诱导动力学参数，主要对fv/fm(最大量子效率)进行了比较，结果如附图6所示。并选择有代表性的样品测量其快速光合作用曲线，结果如附图7所示。由结果可知，青鲜素对紫萍光合能力的影响随着作用浓度的不同有所不同。fv/fm和retr值的变化显示100ppm的处理最为显著，可以促进紫萍光合能力的增强。3.鲜重和干重测定将处理12天的紫萍用抽滤泵将紫萍材料表面的水分吸干后立即称重，即为鲜重，结果如附图4所示。将吸干表面水分的材料放于80℃烘箱，每半小时称重一次，直到重量不再变化为止，为材料的干重，结果如附图5所示。结果显示高于100ppm青鲜素的处理使得紫萍的鲜重和干重显著降低。4.淀粉的提取采用苏州科铭生物科技有限公司的试剂盒，具体方法如下：(1)称取0.1g样本放入5ml的冻存管中，用小研棒研碎，共加入1ml试剂一充分研磨成匀浆后转移入10ml离心管，80℃水浴提取30min，3000g，25℃离心5min，弃上清，留沉淀。(2)沉淀中加入0.5ml蒸馏水，放入95℃水浴中糊化15min。(3)冷去后，加入0.35ml试剂二，25℃常温提取15min，期间振荡3-5次。(4)加入0.85ml蒸馏水，混匀，3000g，25℃离心10min，取上清液用稀释的试剂二进行稀释5-10倍后待测。5.淀粉含量的测定(1)酶标仪预热30min，调节波长至620nm，蒸馏水调零。(2)调节水浴锅至95℃。(3)配制工作液，现用现配。配方：在试剂三中加入3.75ml蒸馏水后，缓慢加入21.25ml浓硫酸，不断搅拌，充分溶解后待用。(4)样品测定。取50μl样本和250μl工作液至2ml冻存管中，95℃水浴10min，自然冷去至室温，取200μl至96孔板中，在620nm波长下测定吸光值，并记录数据。6.淀粉含量的计算标准条件下测定不同浓度的淀粉含量，根据淀粉浓度和对应的od620获得的回归方程为y＝2.936x-0.0295,x为标准品浓度(mg/ml)，y为吸光值。按样本鲜重计算淀粉含量(mg/g鲜重)＝〔(a+0.0295)xv1〕÷2.936÷(wxv1÷v2)＝0.578x(a+0.0295)÷w标准曲线查得的淀粉含量(mg)；v1：加入反应体系样本体积，0.05ml；v2：加入提取液体积，1.7ml；w：样品鲜重(g)。实施例2为进一步说明100ppm青鲜素随着不同时间处理对紫萍生长发育和淀粉积累的影响，分别将对照和100ppm青鲜素处理的紫萍在光照强度均为100μmol/m2·s，周期为16h光照/8h黑暗，温度为22℃的条件下，分别培养10，12，14，16天。培养结束后，同法计数叶状体数目之后，将每组的材料抽滤去掉培养液后测鲜重，并采用相同方法继续进行淀粉提取和含量测定。1.叶状体数目计数和统计结果如图9所示，随着处理时间的延长，对照一直在不断繁殖，株数不断增加，而用100ppm青鲜素处理的紫萍新叶状体的生长几乎被完全抑制，从第10天到第16天，成熟叶状体的数目几乎都维持在70片左右，小叶状体的数目虽有增加，但是差异很小。2.鲜重的测定结果如图10所示。鲜重的变化趋势与叶状体数目的变化趋势相似，同样随着青鲜素作用时间的延长，对照的鲜重在逐渐上升；而100ppm青鲜素处理组鲜重的增加很缓慢，第10天时约为0.32g，第12，14，16天时均约为0.36g。3.淀粉含量的测定结果见图11。由图中数据可知，对照随着培养，淀粉含量到第14天时达到最高，为9％mg/g鲜重，而青鲜素处理组在不同时间点都高于对照，至少约为对照淀粉含量的4.5倍。其中12天，14天和16天的变化增幅不是很显著。参考文献：1.chengjj,stompam.growingduckweedtorecovernutrientsfromwastewatersandforproductionoffuelethanolandanimalfeed[j].clean-soil,air,water,2009,37(1):17-26.2.landr,faowdd,sessagl.foodandagricultureorganizationoftheunitednations,fao,statisticsdivision,http://faostat3.fao.org(accessedjanuary10,2015).3.cuiw,xuj,chengjj,stompam.starchaccumulationinduckweedforbioethanolproduction[j].2011,3(4):187-197.4.xuj,sheng.growingduckweedinswinewastewaterfornutrientrecoveryandbiomassproduction[j].bioresourcetechnology,2011,102(2):848-53.5.liuy,fangy,huangmj,jinyl,sunjl,taox,zhanggh,hekz,zhaoy,zhaoh.uniconazole-inducedstarchaccumulationinthebioenergycropduckweed(landoltiapunctata)ii:transcriptomealterationsofpathwaysinvolvedincarbohydratemetabolismandendogenoushormonecrosstalk[j].biotechnologyforbiofuels,2015,8(1):64.6.yinyh,yucj,yul,zhao,js,suncj,mayb,zhougk.theinfluenceoflightintensityandphotoperiodonduckweedbiomassandstarchaccumulationforbioethanolproduction[j].bioresourcetechnology,2015,187(2015):84-90.7.wangx.,cuiw.,feng,c.,huw..abscisicacid-inducedstarchaccumulationinbioenergycropduckweedspirodelapolyrrhiza[j].bioenergyresearch,2016:1-10.xiaoy,fangy,jinylzhanggh,zhaoh.culturingduckweedinthefieldforstarchaccumulation[j].industrialcrops&products,2013,48(3):183-190.8.huangmj,fangy,liuy,jinyl,sunjl,taox,maxr,hekz,zhaoh.usingproteomicanalysistoinvestigateuniconazole-inducedphytohormonevariationandstarchaccumulationinduckweed(landoltiapunctata)[j].bmcbiotechnology,2014,15(1):1-139.wangy,kandelerr.promotionoffloweringbyatumorpromoter.journalofplantphysiology,1994,144:710–71310.徐爱东，我国蔬菜中常用植物生长调节剂的毒性及残留问题研究进展，中国蔬菜2009，8：1‐6。当前第1页12当前第1页12